DC-SIGN表達(dá)調(diào)控與抗結(jié)核免疫應(yīng)答關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：篩選合適的實(shí)驗(yàn)對象，研究IL-4調(diào)控樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子3結(jié)合非整合素（dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin，DC-SIGN）的表達(dá)對樹突狀細(xì)胞免疫學(xué)功能的影響，進(jìn)而探討DC-SIGN表達(dá)水平與結(jié)核病發(fā)生的關(guān)系。 方法：①密度梯度離心法獲得C57BL/6小鼠骨髓、脾臟和人外周血單個核細(xì)胞，貼壁法去除懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞中加入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因

2、子（GM-CSF）和白細(xì)胞介素-4（IL-4）協(xié)同誘導(dǎo)其分化為樹突狀細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD11c、DC-SIGN、CD80、CD83、CD86和MHC-Ⅱ（或HLA-DR）分子的表達(dá)。②用不同劑量的IL-4（5、10、50、100、200 ng/ml）調(diào)控人外周血來源的DCs表面DC-SIGN的表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測各組DCs表型。⑧根據(jù)加入IL-4劑量將人外周血來源的DCs分為IL-4（5 ng/m

3、l）組和IL-4（50 ng/ml）組，分別加入脂多糖（LPS）、結(jié)核桿菌H37Rv菌懸液共培養(yǎng)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組DCs表型（CD11c、DC-SIGN、CD83、CD86、HLA-DR），ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12、IL-10含量，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法檢測各組DCs刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力。 結(jié)果：①小鼠骨髓、脾臟及人外周血來源的DCs培養(yǎng)7天后具有DCs的典型形態(tài)學(xué)特征。②小鼠骨髓、脾臟來源的DCs培

4、養(yǎng)1天、3天、7天后，DC-SIGN表達(dá)水平均<2％。人外周血來源的DCs培養(yǎng)1天、3天、7天后DC-SIGN表達(dá)水平分別為：52.86％、87.70％、83.37％。③小鼠骨髓來源的DCs培養(yǎng)7天后細(xì)胞表面CD11c、CD80、CD86和MHC-Ⅱ表達(dá)水平分別為：5.42％、2.95％、29.19％、52.59％。小鼠脾臟來源的DCs培養(yǎng)7天后細(xì)胞表面CD11c、CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子表達(dá)水平分別為：4.01％、1.19％

5、、16.16％、54.89％。人外周血來源的DCs培養(yǎng)7天后細(xì)胞表面CD11c、CD83、CD86和HLA-DR表達(dá)水平分別為：93.62％、90.06％、97.54％、99.65％。④當(dāng)加入IL-4的劑量由5 ng/ml增加到50 ng/ml時，DC-SIGN的表達(dá)水平顯著增加（P<0.05）。但當(dāng)IL-4的劑量由50 ng/ml增至200 ng/ml時，DC-SIGN的表達(dá)水平雖仍隨IL-4劑量增加而增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0

6、.05）。⑤表達(dá)不同水平DC-SIGN的DCs成熟度無顯著差異（P>0.05）。⑥表達(dá)不同水平DC-SIGN的DCs加入LPS、H37Rv誘導(dǎo)后，培養(yǎng)液中IL-12含量無顯著差異（P>0.05），加入LPS誘導(dǎo)后培養(yǎng)液中IL-10含量也無顯著差異（P>0.05），但DC-SIGNhigh-DCs加入H37Rv誘導(dǎo)后培養(yǎng)液中IL-10含量明顯高于DC-SIGNlow-DCs（P<0.05）。⑦表達(dá)不同水平DC-SIGN的DCs加入LPS誘

7、導(dǎo)后刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。DC-SIGNhigh-DCs加入H37Rv誘導(dǎo)成熟后與表達(dá)不同水平DC-SIGN的DCs加入LPS誘導(dǎo)成熟后刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力相當(dāng)（P>0.05），但DC-SIGNlow-DCs加入H37Rv誘導(dǎo)后刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯低于其它3組（P<0.05）。 結(jié)論：①小鼠骨髓和脾臟來源的DCs體外培養(yǎng)后細(xì)胞表面DC-SIGN及共刺激分子表達(dá)

8、水平低，且細(xì)胞純度低，無法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，C57BL/6小鼠不適合用于建立研究DC-SIGN的動物模型。人外周血來源的DCs體外培養(yǎng)后細(xì)胞表面DC-SIGN及共刺激分子表達(dá)水平高，且細(xì)胞純度高，適合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②IL-4能調(diào)控DC-SIGN的表達(dá)水平，并呈劑量依賴性。③DC-SIGNhigh-DCs加入H37Rv誘導(dǎo)后分泌IL-10水平明顯高于DC-SIGNlow-DCs，但DC-SIGNlow-DCs加入H37Rv誘導(dǎo)后刺激T淋巴細(xì)胞