放射啟動MIP-3α基因激發(fā)機體抗腫瘤免疫應答的研究.pdf

1、肺癌是發(fā)病率高、預后差的惡性腫瘤之一,近年來,其發(fā)病率和病死率在中國呈上升趨勢.以手術、化療、放療為主的綜合治療是肺癌的主要治療方法,但療效尚不理想,目前肺癌患者總的5年生存率仍低于15﹪.因此亟待尋找治療肺癌的更為有效的手段.生物治療是繼手術、放療及化療之后興起的一種新的治療肺癌的方法,被認為是目前治療肺癌極有前景的治療手段.大量研究證明,有效的抗腫瘤細胞免疫反應的核心是產生CD8+的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T Lym

2、phocyte,CTL).利用CTL對腫瘤進行特異性殺傷,已經成為治療惡性腫瘤的有力手段之一.現(xiàn)已明確,有效活化CTL反應關鍵是抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)能否將"第一信號"(抗原信號)和"第二信號"(共刺激信號)有效的傳遞給初始型T細胞.在所有的抗原遞呈細胞中,功能最強大的則是樹突狀細胞(dendritic cell,DC),它表達高水平MHC分子、共刺激分子;能夠吞噬處理凋亡或壞死腫瘤細胞等

3、顆粒性抗原,具有"交叉遞呈(cross-presentation)"外源性抗原的能力;也是機體有效激發(fā)CTL反應的樞紐.以往的研究證明:DC在體外能夠高效吞噬腫瘤細胞的凋亡小體,獲取抗原,從而誘導特異性CTL反應.隨著DC體外分離、培養(yǎng)技術的成熟,各種以DC為基礎的疫苗也應運而生,并在部分惡性腫瘤的治療中取得了令人振奮的效果.然而,所有以DC為基礎的疫苗制備必需經過DC的體外分離、培養(yǎng)、負載、成熟等步驟,這一臨床操作過程繁瑣,而且費用高

4、.因此,尋找一種操作簡便以樹突狀細胞為基礎的免疫治療策略迫在眉睫.目前已經證實,DC存在于體內多種組織中,如外周血單核細胞(PBMC)中有1﹪的細胞為DC,皮膚中也有DC的存在,即郎罕細胞.因此,可以通過趨化作用使體內DC向腫瘤局部募集而增加DC的數(shù)量.近期的研究表明,多種趨化因子,如巨噬細胞炎癥蛋白-3α (macrophage inflammatory protein-3α,MIP-3α)、RANTES、MIP-1β和SDF-1等,

5、在體內、外對DC均有趨化作用.其中,MIP-3α是一種對未成熟DC有強烈的趨化作用,而對成熟DC卻無趨化作用的趨化因子.因此,我們設想:利用MIP-3α對未成熟DC的強烈趨化特性,將腫瘤周圍組織,甚至遠處的DC趨化到腫瘤局部,遞呈腫瘤來源的外源性抗原,進而激發(fā)機體特異性抗瘤免疫應答.然而,這種設想的局限性是難于在體內有效活化CTL反應.其主要原因有以下兩點:①DC只能吞噬凋亡或壞死的腫瘤細胞(即顆粒性抗原),難于有效吞噬正常的腫瘤細胞,

6、因而無法實現(xiàn)"交叉遞呈"腫瘤抗原的過程;②DC在吞噬外源性抗原后,必須經IL-1β、TNF-α等"危險信號(danger signal)"的刺激才能活化、成熟,而腫瘤局部缺乏上述"危險信號",且未成熟的DC不但不能有效激發(fā)CTL反應,反而會加重機體對腫瘤的免疫耐受.放療是肺癌的主要治療方法之一,它引起腫瘤細胞死亡的最主要方式是細胞凋亡或壞死.放療本身可以起到殺傷腫瘤細胞的目的,又能通過誘導腫瘤細胞凋亡或壞死,為DC提供有效的外源性抗原(

7、凋亡或壞死的腫瘤細胞);還通過誘導免疫刺激因子的分泌,為DC提供成熟、活化必需的"危險信號"(IL-1β、TNF-α等免疫刺激細胞因子)微環(huán)境.基于上述認識,我們設想:若能將局部放療結合MIP-3α基因治療,MIP-3α可將DC募集至腫瘤組織,放療不但可殺傷腫瘤細胞,還可提供DC"交叉激活"CTL反應所必需的條件.此外,放療既可以對MIP-3α基因表達進行空間上的調控,使MIP-3α集中在腫瘤局部表達,從而吸引DCs高效聚集; 還可以進

8、行時間上的調控,以避免MIP-3α的持續(xù)表達,而造成體內DC的無效消耗. 近年來活躍在基因治療領域的早期生長反應-1基因(early growth response-1, Egr-1)啟動子是我們對MIP-3α基因進行時間和空間上的調控的良好工具.Egr-1基因為即刻早期基因(immediate early genes, IEGs)家族成員,是一種含有3個鋅指結構的轉錄因子.該轉錄因子可在輻射、缺氧等應激條件下被活化,通過與DNA序列上

9、的順式作用元件結合,進而誘導目的基因表達.Egr-1基因的5'端上游啟動子區(qū)域含有3個Egr-1的結合元件和CarG盒,應激條件可通過誘導Egr-1、c-fos、c-jun等即刻早期基因的表達,使Egr-1基因的表達在體內呈逐級放大趨勢.根據(jù)Egr-1在應激條件下表達的上述特性,有研究者設計用Egr-1啟動子啟動的TNF-α基因的表達系統(tǒng)進行放療增敏實驗,稱為放射-基因治療,取得了可喜的苗頭.該研究基于DC在抗瘤免疫應答中的重要性和目前

10、DC疫苗的缺陷,提出利用Egr-1啟動子的局部放療的反應,對MIP-3α基因表達的進行時空調控,激發(fā)機體抗瘤免疫應答的新設想.這種設想的工作原理如下:通過放療誘導腫瘤局部DC趨化因子(MIP-3α)的表達,在MIP-3α的作用下,DCs向照射局部聚集,處理放療后凋亡或壞死腫瘤細胞來源的腫瘤抗原,并在放療局部存在的多種免疫刺激因子的作用下成熟、活化,從而"交叉激活"CTL反應.該設想一方面利用Egr-1啟動下游基因表達具有超強而短暫的特性

11、,使MIP-3α的表達隨放射誘導按需開關,實現(xiàn)對MIP-3α基因表達調控,從而更有效的激發(fā)機體產生抗瘤免疫應答;另一方面,該研究有別于以往在Egr-1下游引入的目的基因是具備直接的腫瘤殺傷效應的"治療性基因",而是引入了在表達后可以引發(fā)一些后續(xù)的抗腫瘤免疫效應的"誘導性基因",使目的基因起到"放大器"的作用,對于探討放射-基因治療的靶基因的選擇,也是一種新的思路.基于以上設想,該研究擬將MIP-3α基因串聯(lián)到Eg-1啟動子下游,構建Eg

12、r-1啟動的MIP-3α質粒載體,用其轉染Lewis肺癌細胞,并進行放射誘導,通過體外、體內實驗,觀察MIP-3α表達情況,對DC的趨動情況及對腫瘤治療的效應.該研究有機結合了放射治療、免疫治療和基因治療于一體,對實驗性肺癌的治療進行了全新的嘗試.第一部分 Egr-1為啟動子的MIP-3α表達載體的構建及鑒定 材料及方法:以限制內切酶XbaⅠ+NcoⅠ雙酶切p-Egr質粒,切去CAT基因,0.6﹪瓊脂糖凝膠電泳,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒提

13、取純化,獲得含Egr-1啟動子線性化載體,備用.以pCMV-MIP3α質粒為模板進行PCR擴增MIP-3α片段.用Primer Premier 5軟件設計引物,并在上、下游引物中分別加入XbaⅠ和NcoⅠ酶切位點.用XbaⅠ+NcoⅠ雙酶切PCR產物.用T4 DNA連接酶將上述線性化載體和PCR產物進行連接反應,得到重組質粒pEgr-1-MIP-3α,記為pEgr-MIP3α.以XbaⅠ+NcoⅠ酶切重組質粒中的MIP-3α序列,并由上

14、海Seagon公司進行測序.用堿裂解法及聚乙二醇沉淀純化法大量制備并純化重組質粒.結果:獲得重組質粒pEgr-MIP3α,經酶切鑒定和測序鑒定,確認MIP-3α序列插入正確.大量制備及純化了后續(xù)實驗所需的重組質粒及對照質粒.第二部分 放射誘導Egr-1啟動子調控的MIP-3α基因在Lewis肺癌細胞中的表達 材料及方法:用DOTAP脂質體介導重組質粒pEgr-MIP3α轉染Lewis肺癌細胞,以pEgr質粒轉染為對照,16h后以電子線6

15、Mev分別以2、4、6、8和10Gy和假照射(0Gy)照射.照后24h收集培養(yǎng)上清及細胞.用RT-PCR檢測LLC MIP-3α mRNA表達,經Western blot檢測細胞內MIP-3α蛋白表達,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清內分泌型MIP-3α水平.結果:證實MIP-3α在LLC中有少量表達.對照質粒pEgr轉染的LLC經10Gy放療后,MIP-3α表達無增高.經重組質粒pEgr-MIP3α轉染的LLC,經2-10Gy電子線放射后,

16、MIP-3α表達量明顯高于未轉染者及轉染后未照射(0Gy)者. MIP-3α表達與放射劑量成正比.第三部分 放射啟動MIP-3α基因治療小鼠Lewis肺癌移植瘤的體內實驗研究 材料與方法:建立Lewis肺癌的C57BL/6J小鼠移植瘤皮下模型,待腫瘤長至1cm3左右時 (15天左右),將荷瘤鼠隨機分為6組(n=8):(1)空質粒p-Egr對照組,(2)單純放射治療組,(3)對照質粒pCMV-MIP3α注射組,(4)對照質粒pCMV-MI

17、P3α注射+放療組,(5)pEgr-MIP3α質粒注射組,(6)pEgr-MIP3α質粒注射+放療組.用裸質粒靜脈高容量基因治療方法,將質粒50μg溶于1.6ml-2.2ml生理鹽水中,經小鼠尾靜脈快速注射,在7s內完成.放療組和質粒+放療組于注射治療后8小時進行10Gy放療,放療后24小時處死每組小鼠各2支,取小鼠肝、肺、腫瘤組織提取總RNA,行RT-PCR觀察組織中MIP-3α表達情況.第3天處死每組小鼠各2只,取腫瘤組織行免疫組化

18、檢測DC(CD11c+細胞)及CD8+、CD4+細胞以觀察腫瘤組織中DC浸潤和CTL浸潤情況.兩批小鼠處死時均收集血清行ELISA檢測血清MIP-3α水平.余下小鼠進一步觀察腫瘤生長速度.結果:空質粒對照組和單純放射組中,MIP-3α mRNA在荷瘤小鼠肝、肺及腫瘤組織中均有少量表達,血清中MIP-3α水平很低,腫瘤組織中無明顯DCs和CD8+細胞浸潤.對照質粒pCMV-MIP3α注射組中,小鼠在注射質粒后32小時,小鼠血清內MIP-3

19、α水平顯著上升,小鼠肝、肺及腫瘤組織中MIP-3α mRNA表達量均增高,其中以肝臟最為顯著,腫瘤組織內MIP-3α水平與肺相當;第3天,血清內MIP-3α水平降低,但仍高于空質粒對照和單純放療組,但腫瘤組織內DCs和 CD8+細胞浸潤與空質粒對照和單純放療組無明顯差別.對照質粒pCMV-MIP3α注射+放療組中,放射后MIP-3α mRNA表達和血清MIP-3α水平較均空質粒對照和單純放射組增高,較單純pCMV-MIP3α質粒注射組無

20、增高,DCs和CD8+細胞浸潤較空質粒組、單純放療組和對照質粒注射組無差異.重組質粒pEgr-MIP3α注射組MIP-3α mRNA表達和血清MIP-3α水平與空質粒對照組和單純放療組無明顯差別,且低于對照質粒注射組及對照質粒注射+放療組,腫瘤組織內DCs和CD8+細胞浸潤情況與前4組亦無明顯差別.重組質粒pEgr-MIP3α注射+放療組,放療后腫瘤組織MIP-3α mRNA表達和血清MIP-3α水平,瘤內DCs和CD8+細胞浸潤均較空

21、質粒組、單純放射組、對照質粒注射組、對照質粒注射+放療和pEgr-MIP3α注射組增高.對比各組在放射治療后第15天腫瘤大小,空質粒pEgr注射組、對照質粒pCMV-MIP3α注射組和重組質粒pEgr-MIP3α注射組腫塊明顯大于其他各組,單純放療和pCMV-MIP3α注射+放療組較小,pEgr-MIP3α注射+放療組腫瘤最小(P<0.05).全文小結 1.用定向克隆的方法成功構建了Egr-1啟動子調控的MIP-3α基因的重組質粒載體p

22、Egr-MIP3α.2.體外實驗表明,放射誘導Egr-1啟動子活性可增加該重組質粒轉染后的Lewis肺癌細胞MIP-3α的表達,并可提高細胞培養(yǎng)液中分泌型MIP-3α蛋白水平.3.在C57BL/6J小鼠移植瘤實驗中顯示,接受重組質粒的靜脈高容量基因治療聯(lián)合放射治療的荷瘤小鼠,腫瘤組織內MIP-3αmRNA表達顯著增高,DC和CD8+細胞浸潤最多,小鼠的腫瘤生長速度減慢.以上結果說明,Egr-1啟動子驅動MIP-3α表達增高對腫瘤局部的免