人肝素酶RNA干擾對HepG2肝癌細胞生物學行為的影響.pdf

1、第三軍醫(yī)大學碩士學位論文人肝素酶RNA干擾對HepG2肝癌細胞生物學行為的影響姓名：熊震申請學位級別：碩士專業(yè)：內科學（消化系?。┲笇Ы處煟簵钍嗣?0071101第三軍醫(yī)大學碩士學位論文列，經(jīng)BLAST設計一組無關序列為陰性對照序列；設計包含干擾序列及無關序列的dsDNA并進行生物合成；雙酶切pGenesil1質粒；將合成的dsDNA克隆至酶切質粒；測序鑒定后進行質粒抽提及純化。2培養(yǎng)HepG2細胞，采用脂質體法將各重組干擾質粒穩(wěn)定轉染

2、至HepG2細胞；G418抗性篩選3周；從各組細胞中挑取單克隆擴大培養(yǎng)。3采用RealTimeRTPcR和westemblot分別檢測干擾及未干擾的HepG2細胞肝素酶的表達，篩選有效的干擾序列。4采用不同的實驗技術檢測肝素酶RNA干擾后HepG2細胞增殖能力、細胞周期、克隆形成能力、侵襲能力及體內成瘤能力的變化。實驗結果1通過wwwgenscriptcom網(wǎng)站的0nlinet001s找到三條肝素酶干擾序列，分別為：No1(1214—1

3、232)：5’一GGETATCTCTTCTGTTCAA一3’，No2(167185)：57TCCTGTCCGTCACCATTGA3’，No3(611—629)：5’一CTCAGTTGCTCCTGGACTA3’，及陰性對照序列5’一ACTACCGTTGTATAGGTGT一37；并成功將包含各干擾序列及陰性對照序列的dsDNA克隆至質粒pGenesil1，經(jīng)測序鑒定后，證實所連入的序列與設計序列一致，分別命名為pGenesil一1／Hpa／

4、siRNA一1、pGenesil—1／Hpa／siRNA一2、pGenesil—l／Hpa／siRNA一3、pGenesil—1／Hp“siRNA—N。2采用脂質體法將上述各組干擾質粒成功轉染至HepG2肝癌細胞當中，經(jīng)G418抗性篩選后，得到陽性克?。粩U大培養(yǎng)后各細胞株分別命名為HepG2／RNAi／11、HepG2／RNAi／2—2、HepG2／RNAi／3一l、HepG2／RNAi／3—3、HepG2／RNAi／N。3RealTi

5、meRTPCR結果表明，干擾組HepG2瓜NAi／11、HepG2依NAi／22及HepG2瓜NAi／3—3中Hpa在mRNA表達水平明顯下調，而HepG2瓜NAi／3一l中的Hpa表達與陰性對照組和HepG2組無差別；westernblot檢測結果表明HepG2瓜NAi／11與HepG2瓜NAi／3—3兩組中Hpa蛋白表達水平較HepG2組和HepG2瓜NAi／N組顯著下調，抑制效率分別達到57％、71％。4采用westemblot檢

6、測不同代數(shù)干擾細胞肝素酶的表達，結果表明，在10代以前，Hpa／siRNA1和Hp眺iRNA3可以有效抑制HepG2肝癌細胞肝素酶蛋白的表達。5MTT實驗表明HepG2瓜NAi／1—1與HepG2／RNAi／33組細胞增殖能力明顯低于HepG2組和HepG狐NA淵組；平皿克隆形成實驗表明HepG2瓜NAi／11與HepG2／ItNAi／33組單個細胞形成克隆的能力與HepG2組和HepG2瓜NAi／N組相比顯著降低(344，265vJ1