骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穿過血腦屏障機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，來自中胚層。它除了能分化為骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞<'[1]>，心肌細(xì)胞<'[2]>等中胚層細(xì)胞，還能跨胚層分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞<'[3]>。它移植入腦可以遷移至受損腦區(qū)<'[4]>，通過分化為神經(jīng)細(xì)胞<'[5]>，促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的分化<'[6]>，分泌細(xì)胞因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子<'[7]>等多種機(jī)制促進(jìn)腦損傷后功能的

2、恢復(fù)<'[8]>。又因其不表達(dá)MSCⅡ類分子<'[9]>，且有免疫抑制作用，并能夠穩(wěn)定的表達(dá)外源性基因<'[10]>成為治療腦卒中等累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細(xì)胞。血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是一道天然的生理屏障，它將中樞神經(jīng)系統(tǒng)與其它的系統(tǒng)隔離開。組成血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞是特化的細(xì)胞，它們之間形成緊密連接，成為外周細(xì)胞入腦的主要障礙。采用側(cè)腦室或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)定位注射MSCs的方法操作技術(shù)要求高，并有引起腦水腫及

3、阻塞腦脊液循環(huán)系統(tǒng)等弊病，故其臨床應(yīng)用受限。后來人們發(fā)現(xiàn)經(jīng)尾靜脈向腦梗死的大鼠注入MSCs,移植細(xì)胞可穿過BBB，且有定向遷移至腦損傷的趨勢(shì)<'[11]>。但是到目前為止，MSCs穿過血腦屏障的機(jī)制，尤其是MSCs穿過腦微血管內(nèi)皮屏障的機(jī)制，還很少有人研究。本研究旨在探索MSCs與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，從而為將來體外調(diào)控MSCs高效特異穿過血腦屏障入腦發(fā)揮其修復(fù)神經(jīng)損傷作用提供試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 方法： 1 MS

4、Cs的分離培養(yǎng)和鑒定1．1在無菌條件下取Wistar大鼠股骨和脛骨骨髓細(xì)胞，體外分離，培養(yǎng)和擴(kuò)增。 1．2免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定MSCs表面標(biāo)志CD45和CD90的表達(dá)情況。 2 免疫熒光染色檢測(cè)MSCs作用于HBMECs單層引起HBMECs的緊密連接蛋白ZO-1的變化。 3 Phalloidin染色方法檢測(cè)MSCs作用于HBMECs單層引起HBMECs的F-actin的變化。 4 MSCs跨內(nèi)皮遷移試驗(yàn)

5、4．1 MSCs穿過血腦屏障體外模型的建立。 4．2 利用已建立的模型研究PKC，PI3K/Akt，Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì)MSCs穿過HBMECs的能力影響。 5 Phalloidin染色方法檢測(cè)PKC，P13K/Akt，Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì)MSCs的F-actin的影響。 6 細(xì)胞黏附試驗(yàn)檢測(cè)Rho/ROCK通路對(duì)MSCs黏附與HBMECs能力的影響。 7 利用Transwell檢測(cè)Rho/R

6、OCK通路對(duì)MSCs遷移的影響。 8 Western Blotting法檢測(cè)MSCs與HBMECs作用后引起HBMECs緊密連接蛋白Oecludin的變化。 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果 1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 1．1 分離純化后的MSCs程梭形，在培養(yǎng)皿中呈現(xiàn)規(guī)律的漩渦狀排列 1．2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，所分離細(xì)胞為CD90陽(yáng)性，CD45陰性，符合MSCs特征 2

7、 MSCs作用于HBMECs單層于15分鐘即可黏附于HBMECs，并逐漸伸出片足和較長(zhǎng)的偽足；MSCs能夠引起HBMECs的緊密連接的開放；MSCs能夠引起HBMECs細(xì)胞骨架蛋白F-actin隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)的解聚 3 建立MSC穿過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的模型，并利用該模型發(fā)現(xiàn)了抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠促進(jìn)MSCs穿過HBMECs單層。 4 抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠引起其細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變以

8、及F-actin的解聚。 5 抑制MSCs的Rho/ROCK通路不影響MSCs與HBMECs的黏附。 6 抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠促進(jìn)MSCs的遷移。 7 抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠促進(jìn)MSCs在穿過HBMECs單層過程中引起HBMECs緊密連接的開放。 結(jié)論： 本研究發(fā)現(xiàn)抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠增強(qiáng)MSCs的遷移能力，促進(jìn)MSCs穿過血腦屏障，而且這種促進(jìn)