來源于人樹突狀細胞的新型癌基因樣小G蛋白RabJ的生物學功能研究.pdf

1、在對樹突狀細胞(dendritic cell,DC)cDNA文庫進行大規(guī)模測序的過程中,我們發(fā)現(xiàn)了許多新的與免疫功能和基本生命調(diào)控密切相關(guān)的全長基因.本研究擬對已經(jīng)進行初步研究的新型小GTPase RabJ進行進一步的功能及其作用機制研究.RabJ的全長cDNA來源于樹突狀細胞,包含822bp的開放閱讀框,編碼273個氨基酸的蛋白質(zhì),在人睪丸組織中呈優(yōu)勢表達,在人腫瘤細胞系中有廣泛的表達.以前的研究提示其主要定位于細胞核,可以和熱休克蛋

2、白(heat shock protein,HSP)HSC70結(jié)合.但是其確切的生物學功能仍然未知.經(jīng)過深入的研究和探討,我們證明并推測RabJ可能參與對細胞增殖、細胞周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生等細胞生物學功能的調(diào)控.首先,我們利用RT-PCR、免疫組化等方法進一步確認了RabJ的細胞和組織分布的特點.利用多種細胞系和小鼠組織的總RNA,通過RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn),RabJ是一個分布比較廣泛的分子,在HeLa、Jurkat、Molt-4、NB4

3、、THP-1、U937、MCF-7、PC-3等多種人源造血細胞系白血病細胞和實體瘤內(nèi)均有較高的表達;在小鼠細胞系A(chǔ)20、EL-4、P815、B16、3LL內(nèi)均有不同程度的表達,在小鼠的正常細胞系3T3和骨髓基質(zhì)細胞系TC-1內(nèi)卻沒有表達;在C57BL/6小鼠睪丸、卵巢、腎臟、脾臟、大腦、胃、結(jié)腸和骨骼肌等組織內(nèi)有不同程度表達,在胸腺、肝臟、心臟、肺內(nèi)卻沒有表達.然后,我們研究了RabJ的亞細胞定位.對RabJ的蛋白質(zhì)序列進行進一步的分析

4、,我們發(fā)現(xiàn)在其氨基端18個氨基酸片段內(nèi)含有兩個富含堿性氨基酸的區(qū)域,與描述的細胞核定位信號(nuclear localization signal,NLS)Lys-Arg/Lys-X-Arg/Lys非常類似.為了證明RabJ與細胞增殖的關(guān)系,我們構(gòu)建了全長RabJ和結(jié)構(gòu)缺失突變體,包括hRabJ(1-273)、hRabJ(1-208)、hRabJ(209-273)、hRabJ(19-208)、hRabJ(19-273).在RabJ陰性表

5、達的NIH3T3細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染上述載體,使用新霉素(600-1000 μg/ml)連續(xù)篩選3周,經(jīng)過有限稀釋,建立了穩(wěn)定表達細胞系.我們用[3H]-TdR摻入法,觀測了細胞增殖的速率.總之,我們對癌基因樣蛋白RabJ進行了系統(tǒng)的研究,初步揭示其生物學功能與細胞增殖和細胞分化的調(diào)控相關(guān).RabJ可能是一個癌基因樣小G蛋白,因為其可以促使正常成纖維細胞NIH3T3細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,并且在體內(nèi)產(chǎn)生致瘤性.其作用機制可能是通過作為磷酸化MEK1/2的胞