重癥肌無力抗乙酰膽堿受體單鏈抗體A7基因真核表達載體的構建.pdf

1、重癥肌無力(myastheniagravis，MG)是抗乙酰膽堿受體(acetylcholinereceptor,AchR)抗體介導的器官特異性自身免疫病。AchR是由α2βγδ五個同源亞單位組成的跨膜糖蛋白，MG患者血清中多數(shù)抗AchR抗體針對的是α亞單位上的主要免疫原區(qū)(mainimmunogenicregion，MIR)。當致病性抗體與神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上相鄰兩個AchRα亞單位上的MIR相結合后，通過抗原調(diào)變或激活補體作用使

2、突觸后膜損傷，AchR數(shù)量減少，結果出現(xiàn)肌肉收縮無力。由抗AchR抗體制備的單鏈抗體(singlechainvariablefragment，ScFv)作為單價片段，只能與一個α亞單位上的MIR結合，因此不引起抗原調(diào)變作用，且ScFv無Fc段，不能激活補體導致AchR損傷；但是，ScFv與MIR結合后，可以特異性地封閉抗AchR抗體的結合位點，從而對AchR起到保護作用。 本實驗應用聚合酶鏈反應(PCR)方法從重組質(zhì)粒pHEN2

3、-ScFvA7上擴增出鼠源性ScFvA7基因，應用純化試劑盒進行純化。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和AvrⅡ雙酶切后用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收并純化，再與經(jīng)同樣酶切并純化的真核表達載體pPIC9K連接。將連接產(chǎn)物轉化E.coliDH5α并擴增，再用AvrⅡ和EcoRⅠ酶切檢查ScFvA7基因插入的正確性。構建pPIC9K-ScFvA7重組載體經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)核苷酸序列正確，并且ScFvA7基因正確克隆至載體開放讀碼框架內(nèi)。結果表明已成功的構