粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞來(lái)源exosomes抑制小鼠炎性腸病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　制備粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞(granulocytic myeloid-derived suppressor cells，G-MDSC)來(lái)源的exosomes(G-MDSC exo)，研究G-MDSC exo的免疫抑制功能;觀察G-MDSC exo在葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfact sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠炎性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）中的作用及其機(jī)制。

2、r>　　方法：
　　(1)G-MDSC exo制備及鑒定
　　構(gòu)建荷瘤小鼠模型，磁珠分選G-MDSC并體外培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，聯(lián)合超速離心技術(shù)，膜超濾技術(shù)以及相關(guān)試劑制備G-MDSC exo。通過(guò)透射電子顯微鏡觀察G-MDSCexo的形態(tài)和大小，通過(guò)Western blot對(duì)G-MDSC exo表面分子CD63進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比色法檢測(cè)精氨酸酶1（arginase1，Arg-1）活性。
　　(2)G-MDSC exo的免

3、疫抑制功能檢測(cè)
　　磁珠分離小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，抗CD3/CD28抗體刺激其增殖，并在體系中加入不同劑量的G-MDSC exo，以中性粒細(xì)胞來(lái)源的exosomes(neutrophil derived exosomes，Neu exo)作陰性對(duì)照組，通過(guò)3H-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine，3H-TdR)摻入法檢測(cè)各組CD4+T細(xì)胞增殖情況。利用雞卵白蛋白(ovalbumin，OVA)構(gòu)建小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)（del

4、ayed type hypersersitivity, DTH）模型，在初次免疫后的第2天、第4天及第6天分別通過(guò)小鼠腹腔注射30μg G-MDSC exo，并以Neu exo作陰性對(duì)照，在第7天進(jìn)行激發(fā)試驗(yàn)，記錄激發(fā)后的24h、36h及72h小鼠足墊厚度，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)小鼠足墊腫脹情況。通過(guò)Arg-1抑制劑nor-NOHA（Nω-hydroxy-nor-Arginine，NN）阻斷G-MDSC exo中Arg-1活性后，再次利用T細(xì)胞增

5、殖試驗(yàn)和DTH小鼠模型觀察Arg-1在G-MDSC exo免疫抑制功能中的作用。
　　(3)G-MDSC exo促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)擴(kuò)增磁珠分離小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，在抗CD3/CD28抗體活化下，用TGF-β誘導(dǎo)其向Treg細(xì)胞分化，在培養(yǎng)體系中加入不同劑量的G-MDSC exo或者Neu exo，培養(yǎng)72h后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)CD4+CD2

6、5+Foxp3+ Treg細(xì)胞的比例。
　　(4)G-MDSC exo抑制小鼠IBD的發(fā)展
　　通過(guò)自由飲用2.5％ DSS的方式誘導(dǎo)小鼠IBD，在飲水的第2天、第4天和第6天分別給小鼠腹腔注射30μg的G-MDSC exo，并以Neu exo作為陰性對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天記錄小鼠的體重變化、糞便性狀及便血情況，計(jì)算各種小鼠不同時(shí)間的疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI);在飲用DSS的第8

7、天，處死小鼠，分離結(jié)腸組織，觀察結(jié)腸標(biāo)本外觀并測(cè)量長(zhǎng)度，蘇木伊紅(haematoxylin and eosin，HE)染色觀察炎癥浸潤(rùn)情況并進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。
　　通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠腸系膜淋巴結(jié)中輔助T細(xì)胞1型(helper T cell type1，Th1)和Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子α（t

8、umor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素γ(interferonγ，IFN-γ)水平。
　　結(jié)果：
　　(1)從G-MDSC培養(yǎng)上清中分離出G-MDSC exo;鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示:G-MDSC exo為圓形或橢圓形的微囊狀結(jié)構(gòu)，粒徑多為30-100nm，表達(dá)CD63分子，不表達(dá)鈣聯(lián)接蛋白(Calnexin)，其裂解液中能檢測(cè)到Arg-1活性。
　　(2)在體外，CD4+T細(xì)胞增殖體系中，60、

9、90μg/ml G-MDSC exo處理組的每分鐘脈沖數(shù)(counts per minute，CPM)低于空白對(duì)照組和Neu exo處理組（P＜0.01或P＜0.05），而30μg/ml G-MDSC exo組沒(méi)有明顯變化(P＞0.05)。在Arg-1阻斷實(shí)驗(yàn)中，60、90μg/ml(G-MDSC+NN) exo處理組的CPM均低于G-MDSC exo處理組(P＜0.05)。結(jié)果表明在體外G-MDSC exo可有效抑制CD4+T細(xì)胞增殖

10、，IFN-γ分泌，并且這種抑制效應(yīng)與G-MDSC exo中Arg-1分子有關(guān)。
　　在小鼠DTH實(shí)驗(yàn)中，激發(fā)后24h、48h和72h，G-MDSC exo處理組小鼠的足墊腫脹程度明顯低于Neu exo或(G-MDSC+NN) exo處理組（P＜0.01或P＜0.05），表明G-MDSC exo可有效減輕小鼠DTH反應(yīng)。
　　(3)60μg/ml或90μg/ml G-MDSC exo處理組Treg細(xì)胞比例明顯高于空白對(duì)照組（P

11、＜0.01或P＜0.05），而30μg/ml G-MDSC exo處理組無(wú)明顯增加(P＞0.05)，并且G-MDSC exo呈劑量依賴(lài)性地增加誘導(dǎo)體系中Treg細(xì)胞的百分比。
　　(4)造模第6、7天，較Neu exo或（G-MDSC+NN）exo處理組，G-MDSC exo處理組小鼠DAI均下降(P＜0.05);造模第8、9及10天，較Neu exo處理組，G-MDSCexo處理組小鼠DAI均顯著減少(P＜0.01)，較(G-M

12、DSC+NN) exo處理組，G-MDSCexo處理組小鼠DAI均減少(P＜0.05)。
　　造模第8天，較Neu exo處理組，G-MDSC exo處理組小鼠結(jié)腸充血腫脹程度，結(jié)腸縮短程度，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度及病理評(píng)分均減輕或明顯減輕(P＜0.05或P＜0.01)，而(G-MDSC+NN) exo處理組較G-MDSC exo處理組上述各指標(biāo)均增加均增加(P＜0.05)。表明G-MDSC exo能有效改善小鼠IBD，并且與Arg-1

13、有關(guān)系。
　　造模第8天，較Neu exo處理組，G-MDSC exo處理組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中Th1細(xì)胞比例減少(P＜0.05)，Treg細(xì)胞比例增多(P＜0.05)，血清TNF-α和IFN-γ水平下降(P＜0.05);較G-MDSC exo處理組，(G-MDSC+NN) exo處理組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中Th1細(xì)胞比例增加(P＜0.05)，Treg細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P＞0.05)，血清TNF-α和IFN-γ水平下降(P＜0.05)

14、。表明G-MDSC exo通過(guò)抑制Th1介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及促進(jìn)Treg細(xì)胞從而有效抑制小鼠IBD，并且這種抑制作用與Arg-1有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　(1)成功制備G-MDSC exo;證明G-MDSC exo能抑制CD4+T細(xì)胞增殖和DTH反應(yīng)，并且一定程度上依賴(lài)于Arg-1;并且G-MDSC exo能有效增加體外誘導(dǎo)體系中Treg細(xì)胞的比例。
　　(2)G-MDSC exo可有效減輕小鼠IBD的疾病程度，這與其抑制Th