睪丸支持細(xì)胞內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2調(diào)控精子的發(fā)生.pdf

1、支持細(xì)胞(sertoli cell)為各級(jí)生精細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)、支持、保護(hù)作用，分泌一些對(duì)精子發(fā)生有重要作用的成分，參與FSH、睪酮對(duì)生殖細(xì)胞的的調(diào)節(jié)作用。
　　Shp2是一種細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酪氨酸磷酸酶，彌散性表達(dá)于全身各器官，調(diào)控多種生長(zhǎng)因子的信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、參與免疫反應(yīng)、調(diào)控代謝。研究支持細(xì)胞當(dāng)中的Shp2對(duì)精子發(fā)生的調(diào)控具有理論意義和實(shí)用價(jià)值。雖然在努男綜合癥(noonan)中涉及過(guò)Shp2與雄性生殖的關(guān)系，以及大鼠睪

2、丸支持細(xì)胞中Shp2介導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的Ras-MAPK信號(hào)通路，過(guò)表達(dá)Shp2破壞血睪屏障marker(Zo-1，N-cadherin，β-cantenin，F(xiàn)-actin)的表達(dá)分布，且在小鼠整個(gè)睪丸或者在生殖細(xì)胞內(nèi)敲除Shp2都能導(dǎo)致雄性不育，但Shp2在睪丸支持細(xì)胞內(nèi)的作用與功能還未完全探討。
　　利用兩種模型Shp2flox/floxpAMH-cre、Shp2floxp/floxpinhibinα-cre，特異

3、性的在睪丸支持細(xì)胞、支持細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞當(dāng)中去除Shp2。Shp2去除后，2周小鼠睪丸明顯減小，發(fā)育受阻，成年雄鼠100％不育。HE染色表明，3周開始睪丸出現(xiàn)空泡化，并可見(jiàn)睪丸結(jié)構(gòu)破壞、精子發(fā)生受阻;8周附睪中不見(jiàn)成熟精子。雖然直到4周，TUNEL法檢測(cè)到睪丸切片內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)增加，但支持細(xì)胞marker-WT1免疫熒光染色表明，支持細(xì)胞數(shù)量一直沒(méi)有減少，到成年后，有部分曲細(xì)精管中只剩下支持細(xì)胞，沒(méi)有生殖細(xì)胞。
　　未分化的精原細(xì)胞m

4、arker-PLZF、精母細(xì)胞marker-S TRA8、減數(shù)分裂的marker-S CP3免疫熒光染色表明，2周精原干細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞的數(shù)量明顯減少了。然而在1周，精原干細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有受影響;減數(shù)分裂啟動(dòng)marker-STRA8和減數(shù)分裂中的marker-SCP3的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)卻增加了，這表明精原干細(xì)胞分化增強(qiáng)了。進(jìn)一步，精原細(xì)胞自我更新的marker-PH3與PLZF雙染，及KIT的單染實(shí)驗(yàn)表明:Shp2在支持細(xì)胞去除后，對(duì)精原干細(xì)胞

5、的自我更新影響甚微，但在早期引起精原干細(xì)胞的過(guò)度分化。在探討分子機(jī)制上，Shp2在支持細(xì)胞去除后，引起支持細(xì)胞旁分泌蛋白SCF，BMP4（調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞分化的因子）的表達(dá)量升高，而調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞增殖的因子GDNF表達(dá)量不變;采用基因表達(dá)譜芯片分析，許多關(guān)于精原干細(xì)胞增殖與分化的基因表達(dá)產(chǎn)生了變化，如:LIN28a，Epcam，Etv5等。這些結(jié)果表明在支持細(xì)胞Shp2的去除打破了精原干細(xì)胞增殖與分化平衡，引起早期精原干細(xì)胞的過(guò)度分化。<

6、br>　　免疫組化與免疫熒光染色表明，與對(duì)照相比，支持細(xì)胞敲除組中的血睪屏障marker----緊密連接蛋白Claudin11、間隙連接蛋白Cx43，2周開始分布有明顯區(qū)別，表達(dá)量升高;緊密連接蛋白JAM-A在睪丸切片上連接消失，僅在支持細(xì)胞核內(nèi)有表達(dá)，在組織中表達(dá)量顯著降低。組織免疫熒光染色表明，緊密連接蛋白Zo-1分布沒(méi)有明顯區(qū)別，表達(dá)量不變，而在4周黏附連接蛋白β-catenin表達(dá)量減少。在探討分子機(jī)制上，Shp2在支持細(xì)胞去除

7、后，血睪屏障調(diào)節(jié)蛋白TPA的表達(dá)量升高，而它的同類UPA的表達(dá)量不變。采用基因表達(dá)譜芯片分析，很多有關(guān)血睪屏障的基因的表達(dá)量發(fā)生變化，這些基因包括血睪屏障的某些marker（Claudin1，5，8，10，15下降，Cx43上升，TES下降）及調(diào)節(jié)蛋白(Icam1，Mmp2，Mmp17下降)。這些結(jié)果表明Shp2是血睪屏障的重要調(diào)控蛋白。TER實(shí)驗(yàn)表明，在敲除Shp2支持細(xì)胞內(nèi)恢復(fù)Shp2的表達(dá)，能逆轉(zhuǎn)支持細(xì)胞間的緊密連接程度;在正常支

8、持細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)Shp2，緊密連接程度減弱。這個(gè)結(jié)果表明支持細(xì)胞內(nèi)合適的Shp2活性對(duì)血睪屏障的組裝是必須的。我們進(jìn)一步探討了這個(gè)體系的機(jī)制，在支持細(xì)胞內(nèi)敲除Shp2能抑制P-ERK的活性，而增加P-AKT的活性，轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Shp2的突變體(Q79P)能恢復(fù)P-ERK的活性，又能抑制P-AKT的表達(dá)（不論在對(duì)照還是在敲除細(xì)胞內(nèi)）。
　　在信號(hào)通路機(jī)制探討方面，在支持細(xì)胞內(nèi)Shp2的缺失能抑制FSH和睪酮刺激的P-ERK的活性，而使卵

9、泡刺激素(FSH)和睪酮(testosterone)刺激的P-AKT的活性進(jìn)一步的升高;在支持細(xì)胞內(nèi)Shp2的缺失能抑制FSH刺激ABP的升高，而使睪酮刺激的AR進(jìn)一步的升高。Western blot分析了2周睪丸組織內(nèi)FSH和睪酮target gene的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SCSKO組中Pem，ABP，PDGF-A，E-FABP的表達(dá)量下降;SCF，AR，DMRT1的表達(dá)量上升;AMH，F(xiàn)SHR，GDNF，WT1，Dhh，TRF，β-caten

10、in,N-cadherin的表達(dá)量沒(méi)有改變。
　　在TM4細(xì)胞中，Shp2的特異性抑制劑PHPS1抑制FSH引起P-ERK、P-AKT的上升，說(shuō)明Shp2可通過(guò)支持細(xì)胞的FSH的MAPK，AKT信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。Shp2的特異性抑制劑PHPS1能抑制睪酮(T)引起TM4細(xì)胞P-ERK的上升，說(shuō)明Shp2可參與支持細(xì)胞的睪酮(T)的MAPK信號(hào)通路，來(lái)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。此外，PHPS1能抑制FSH引起的TM4細(xì)胞功能性