Mdr-1基因siRNA表達(dá)載體聯(lián)合磁性納米Fe-,3-O-,4-逆轉(zhuǎn)K562-A02細(xì)胞多藥耐藥的研究.pdf

1、目的：研究發(fā)夾狀小分子干擾RNA（small RNA interference，siRNA）聯(lián)合磁性納米四氧化三鐵顆粒[magnetic nanoparticle of Fe3O4，MNP（Fe3O4）]逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/AO2多藥耐藥的作用及其逆轉(zhuǎn)耐藥的效果，為臨床白血病的治療提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法:（1）分別以mdr-1 mRNA第3491-3509，1539-1557和3103-3121核苷酸作為

2、靶點(diǎn)，合成針對(duì)靶區(qū)域序列的發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA）克隆入pGCSilencer-U6-Ne0-GFP載體，重組質(zhì)粒分別為PGY1-1，PGY1-2和PGY1-3。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和序列測(cè)定以證實(shí)重組質(zhì)粒打靶序列的正確性。（2）因該載體同時(shí)表達(dá)GFP標(biāo)記基因，熒光顯微鏡下觀察在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染K562/AO2細(xì)胞足否發(fā)綠色熒光，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率

3、。（3）轉(zhuǎn)染K562/AO2細(xì)胞株后篩選陽(yáng)性表達(dá)載體，篩選出mdr-1基因抑制率最高的載體，然后與攜載有柔紅霉素（daunorubicinDNR）的MNP（Fe3O4）共培養(yǎng)48h。（4）采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time reversetranscript polymerase chain reaction，Real time RT-PCR）檢測(cè)mdr-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄情況。（5）蛋白免疫印跡法（western bl

4、ot，WB）法觀察P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達(dá)。（6）應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素的濃度。
　　 結(jié)果:（1）成功構(gòu)建mdr-1基因siRNA表達(dá)載體，PCR電泳圖譜和測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的打靶序列完全正確。（2）熒光顯微鏡下K562/AO2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為（19.9±1.2）％。（3）重組質(zhì)粒PGY1-1，PGY1-2和PGY1-3中，PGY1-2對(duì)mdr

5、-1基因轉(zhuǎn)錄抑制率最高且P-gp的表達(dá)量最低。（4）Real time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞mdr-1mRNA的轉(zhuǎn)錄情況：①K562細(xì)胞mdr-1 mRNA轉(zhuǎn)錄為陰性，K562/AO2細(xì)胞mdr-1mRNA轉(zhuǎn)錄為陽(yáng)性。②單用PGY1-2或攜載DNR的MNP（Fe3O4）均能下調(diào)K562/A02細(xì)胞的mdr-1mRNA轉(zhuǎn)錄，當(dāng)PGY1-2和攜載DNR的MNP（Fe3O4）聯(lián)合作用于K562/A02細(xì)胞時(shí)，mdr-1mRNA轉(zhuǎn)錄明顯降低，與

6、二者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。（5）Western blot法檢測(cè)P-gp表達(dá)結(jié)果顯示：與K562細(xì)胞相比，K562/A02細(xì)胞的P-gp表達(dá)水平較高。與K562/A02細(xì)胞空白對(duì)照組相比，10μg/ml MNP（Fe3O4）或PGY1-2單獨(dú)作用時(shí)，均可降低K562/A02細(xì)胞的P-gp水平，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。與單用1.0μg/ml DNR相比，10μg/mlMNP（Fe3O4）攜載1.0μg/

7、ml的DNR或經(jīng)PGY1-2轉(zhuǎn)染和1.0μg/mlDNR處理，K562/A02細(xì)胞的P-gP水平下調(diào)更明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。當(dāng)轉(zhuǎn)染了PGY1-2的K562/A02細(xì)胞與攜載1.0μg/ml DNR的10μg/ml MNP（Fe3O4）共培養(yǎng)48h后，P-gp水平下調(diào)最明顯，與單用1.0μg/ml DNR組，10μg/ml MNP（Fe3O4）+1.0μg/ml DNR組和PGY1-2+1.0μg/ml DNR組相比，差

8、別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。（6）流式結(jié)果顯示：?jiǎn)斡肞GY1-2或攜載DNR的MNP（Fe3O4）均能使K562/A02細(xì)胞內(nèi)DNR濃度增加，當(dāng)PGY1-2和攜載DNR的MNP（Fe3O4）聯(lián)合作用時(shí)K562/A02細(xì)胞內(nèi)DNR濃度增加最明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。K562/A02分別經(jīng)，空白對(duì)照組（K562/A02），DNR，DNR和MNP（Fe3O4），DNR和PGY1-2，DNR、MNP（Fe3O4）和PGY1-

9、2，處理后細(xì)胞內(nèi)藥物濃度分別為：170±12，2490±19，3318±22，5513±20，6930±12。
　　 結(jié)論:1.攜載有DNR的磁性納米Fe3O4顆?？梢韵抡{(diào)K562/A02細(xì)胞mdr-1mRNA的轉(zhuǎn)錄和降低P-gp水平的表達(dá)。2.mdr-1基因siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞時(shí)可以下調(diào)mdr-1mRNA的轉(zhuǎn)錄和降低P-gp水平的表達(dá)。3.mdr-1基因siRNA表達(dá)載體和攜載有DNR的磁性納米Fe3O4