有機(jī)鐵源的化學(xué)特性、對(duì)肉仔雞的相對(duì)生物學(xué)利用率及其小腸鐵吸收研究.pdf

1、本論文共通過五個(gè)系列試驗(yàn)，分析了有機(jī)鐵源的化學(xué)特性，研究了不同絡(luò)（螯）合強(qiáng)度[complex(chelation) strength，quotient of formation(Qf) values，Qf值]有機(jī)鐵對(duì)肉仔雞的相對(duì)生物學(xué)利用率，以及其無機(jī)鐵及不同絡(luò)（螯）合強(qiáng)度有機(jī)鐵在肉仔雞小腸各段的吸收規(guī)律和機(jī)制。
　　試驗(yàn)一有機(jī)鐵源的化學(xué)特性研究
　　利用等離子體發(fā)射光譜法、滴定法、高效液相色譜法和極譜法分析了24種有機(jī)鐵源

2、（包括6種蛋氨酸鐵(Fe-Mets1-6)、10種甘氨酸鐵（Fe-Glys1-10）、1種賴氨酸鐵（Fe-Lys）、4種蛋白鐵（Fe-Prots1-4）、3種復(fù)合氨基酸鐵（Fe-AAs1-3）以及試劑級(jí)硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）的總鐵含量、三價(jià)鐵離子（Fe3+）含量、氨基酸組成、在pH2.0、0.2 M HCl-KCl與pH5.0、0.1 M KH2PO4-K2HPO4的緩沖溶液及去離子水中的溶解度以及各有機(jī)鐵源的Qf值。

3、　　結(jié)果表明：
　　1）24種有機(jī)鐵源產(chǎn)品的總鐵含量在10.2～20.1％之間，同時(shí)含有不同程度的Fe3+（0～5.66%）；
　　2）所測(cè)24種有機(jī)鐵源產(chǎn)品的總氨基酸與鐵的摩爾比為0.80：1～2.48：1，其中6種（Fe-Met2、Fe-Gly1、Fe-Gly10、Fe-Prot1、Fe-Prot4和Fe-AA3）有機(jī)鐵源的摩爾比小于1:1（氨基酸：鐵），1種有機(jī)鐵源（Fe-Prot2）的摩爾比大于2:1（氨基酸：鐵），

4、其它12種有機(jī)鐵源的摩爾比介于1：1～1：2之間；
　　3）有機(jī)鐵源在不同的溶劑中溶解度差異很大，介于0～100%之間，其中在pH2.0、0.2 M HCl-KCl中的溶解度>在去離子水中的溶解度>在pH5.0、0.1 M的KH2PO4-K2HPO4中的溶解度；
　　4）有19種有機(jī)鐵源產(chǎn)品（Fe-Mets1-6、Fe-Glys1-10、Fe-Lys、Fe-Prot4和Fe-AA2）的Qf值低于10，屬于弱絡(luò)（螯）合強(qiáng)度有機(jī)

5、鐵源，有4種有機(jī)鐵源產(chǎn)品（Fe-Prot1、Fe-Prot3、Fe-AA1和Fe-AA3）的Qf值介于10～100之間，屬于中等絡(luò)（螯）合強(qiáng)度有機(jī)鐵源，1種有機(jī)鐵源（Fe-Prot2）的Qf值為8,590，超過1000，屬于極強(qiáng)螯合強(qiáng)度有機(jī)鐵源。以上研究結(jié)果表明，有機(jī)鐵源間的化學(xué)特性變異很大，為評(píng)價(jià)不同有機(jī)鐵源對(duì)肉仔雞的相對(duì)生物學(xué)利用率與其Qf值之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)二肉仔雞對(duì)不同絡(luò)（螯）合強(qiáng)度有機(jī)鐵源的相對(duì)生物學(xué)利用率

6、研究
　　1）由于有機(jī)鐵源的絡(luò)（螯）合強(qiáng)度是決定其相對(duì)生物學(xué)利用率的最重要的化學(xué)特性，故綜合考慮上述24種有機(jī)鐵源化學(xué)特性，從中選出分別屬于不同絡(luò)（螯）合強(qiáng)度類別的3種有機(jī)鐵源，即弱絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵（Fe-Met2，標(biāo)記為Fe-Met W，14.7%Fe，Qf=1.37）、中等絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵（Fe-Prot1，標(biāo)記為Fe-Prot M，14.2%Fe，Qf=43.6）和極強(qiáng)螯合強(qiáng)度有機(jī)鐵（Fe-Prot2，標(biāo)記為Fe-Prot ES

7、，10.2%Fe，Qf=8,590）。選用1,170只1日齡商品代愛拔益加（Arbor Acres，AA）肉公雛進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，通過觀測(cè)在玉米-豆粕常用飼糧下，添加不同鐵源及鐵水平對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、血液指標(biāo)、組織鐵含量、組織過氧化氫酶（Catalase，CAT）和琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）活性及其基因表達(dá)的影響，以評(píng)價(jià)肉仔雞對(duì)不同絡(luò)（螯）合強(qiáng)度有機(jī)鐵源的相對(duì)生物學(xué)利用率。試驗(yàn)雞按4╳3+1兩因子

8、安排的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)按體重隨機(jī)分為13個(gè)處理組（每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞），分別飼喂不添加鐵的玉米一豆粕型基礎(chǔ)飼糧（為對(duì)照組，含鐵實(shí)測(cè)為55.8 mg/kg）和在對(duì)照組基礎(chǔ)飼糧中以無機(jī)硫酸亞鐵及以上3種弱、中和極強(qiáng)絡(luò)（螯）合強(qiáng)度的有機(jī)鐵源的形式分別添加鐵20、40和60 mg/kg。試驗(yàn)期為21天，分別于7、14和21日齡采樣分析。結(jié)果表明：1）隨飼糧中鐵水平的增加，14日齡雞血漿鐵飽和度、7日齡和14日齡雞脛骨鐵含量、7日齡、14

9、日齡和21日齡雞肝臟鐵含量、14日齡雞腎臟鐵含量、21日齡雞肝臟以及7和21日齡雞腎臟SDH酶活、14日齡雞肝臟和心臟CAT mRNA水平、21日齡雞肝臟和腎臟SDH mRNA水平均顯著線性增加（P <0.05）；
　　2）以肉仔雞的實(shí)際鐵采食量對(duì)上述指標(biāo)作多元線性回歸分析，以斜率比法計(jì)算各鐵源的相對(duì)生物學(xué)利用率時(shí)發(fā)現(xiàn)，僅以21日齡雞肝臟和腎臟SDH mRNA為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，各鐵源之間差異顯著（P<0.05）；
　　

10、3）以21日齡雞肝臟SDH mRNA為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，弱、中等和極強(qiáng)絡(luò)（螯）合強(qiáng)度有機(jī)鐵相對(duì)于無機(jī)硫酸亞鐵（100%）的生物學(xué)利用率分別為129%（P=0.18）、164%（P<0.003）和174%（P<0.001）；以21日齡雞腎臟SDH mRNA水平作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，以上三種有機(jī)鐵源的相對(duì)生物學(xué)利用率分別為102%（P=0.95）、143%（P=0.09）和174%（P<0.004）。其中，極強(qiáng)螯合強(qiáng)度有機(jī)鐵源的生物學(xué)利用率顯著高于弱絡(luò)

11、合強(qiáng)度有機(jī)鐵源與無機(jī)硫酸亞鐵（P<0.05），中等絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵與極強(qiáng)螯合強(qiáng)度有機(jī)鐵之間以及弱絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵與無機(jī)硫酸亞鐵之間的生物學(xué)利用率差異不顯著（P>0.05）。
　　本次試驗(yàn)研究結(jié)果提示，21日齡肉仔雞肝臟和腎臟SDH mRNA水平為評(píng)價(jià)肉仔雞對(duì)不同鐵源生物學(xué)利用率的特異敏感功能性指標(biāo)；并以其為評(píng)價(jià)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)獲得Fe-Met W、Fe-Prot M和Fe-Prot ES相對(duì)于無機(jī)硫酸亞鐵（100%）的生物學(xué)利用率分別為1

12、16、154和174%；采用實(shí)用飼糧并在肉仔雞鐵需要量上下添加不同水平鐵，采用多元線性斜率比法，以特異敏感功能指標(biāo)評(píng)價(jià)獲得的不同鐵源對(duì)肉仔雞的相對(duì)生物學(xué)利用率結(jié)果更科學(xué)更具實(shí)用性。
　　試驗(yàn)三用原位結(jié)扎灌注腸段法研究無機(jī)硫酸亞鐵在肉仔雞小腸中的吸收規(guī)律及其分子機(jī)制
　　本試驗(yàn)包括2個(gè)小試驗(yàn)，用原位結(jié)扎灌注腸段法研究無機(jī)硫酸亞鐵在肉仔雞十二指腸、空腸及回腸的吸收動(dòng)力學(xué)模式及其與二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Divalent Meta

13、l Transporter1，DMT1）和高鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體1（Ferroportin，F(xiàn)PN1）基因表達(dá)的相關(guān)性。試驗(yàn)1通過研究不同灌注時(shí)間點(diǎn)時(shí)肉仔雞小腸各段無機(jī)硫酸亞鐵吸收率的變化規(guī)律，以確定研究肉仔雞結(jié)扎小腸各段鐵吸收動(dòng)力學(xué)的適宜灌注時(shí)間。選用100只28日齡鐵缺乏的商品代肉公雞，按體重隨機(jī)分為5個(gè)處理組（每個(gè)處理組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只雞），灌注25μg/ml（0.45 mM）的無機(jī)鐵（硫酸亞鐵），共設(shè)0、5、15、30和60 min

14、，共5個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果表明，在0～60 min內(nèi)，無機(jī)鐵在肉仔雞結(jié)扎十二指腸和空腸的吸收率均呈漸近線變化，而在回腸中呈現(xiàn)二次曲線變化。根據(jù)灌注時(shí)間變化擬合方程得到十二指腸、空腸和回腸達(dá)到最大吸收率的時(shí)間分別為60、60和43 min。十二指腸鐵吸收率在灌注后30、45和60 min時(shí)顯著（P<0.006）高于空腸鐵吸收率，并在60 min時(shí)高于回腸（P<0.03）。在30 min時(shí)各腸段鐵吸收率均達(dá)到了最大吸收率的85.0%以上，故在

15、試驗(yàn)2中采用的適宜灌注時(shí)間為30 min。試驗(yàn)2通過結(jié)扎肉仔雞小腸各段并灌注不同鐵濃度0（0 mM）、6.25（0.11 mM）、12.5（0.22 mM）、25（0.45 mM）、50（0.89 mM）、100（1.78 mM）、或200（3.56 mM）μg/ml的硫酸亞鐵，觀測(cè)無機(jī)鐵吸收速率與灌注鐵濃度之間的關(guān)系，揭示無機(jī)鐵在肉仔雞小腸各段的吸收動(dòng)力學(xué)模式，并通過檢測(cè)小腸各腸段DMT1和FPN1 mRNA表達(dá)水平來研究DMT1和F

16、PN1在鐵吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。試驗(yàn)2選用與試驗(yàn)1相同的28日齡缺鐵商品代AA肉公雞70只，按體重隨機(jī)分為7個(gè)處理組（每個(gè)處理組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只雞）。肉仔雞小腸各段鐵吸收動(dòng)力學(xué)模型表明，十二指腸和空腸的鐵吸收符合飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)模式，回腸鐵吸收符合非飽和擴(kuò)散模式。十二指腸DMT1 mRNA表達(dá)水平都顯著（P<0.0001）高于空腸和回腸，空腸顯著高于（P<0.009）回腸。以上結(jié)果表明，十二指腸和空腸的鐵吸收以飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)模式為主，回腸

17、鐵吸收以非飽和擴(kuò)散模式為主，鐵在十二指腸和空腸中的吸收方式可能與其DMT1和FPN1的表達(dá)有關(guān)。
　　試驗(yàn)四用原位結(jié)扎灌注腸段法研究不同形態(tài)鐵在肉仔雞小腸中的吸收規(guī)律
　　采用2╳8二因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共16個(gè)處理組。設(shè)置2個(gè)灌注鐵濃度，分別為：200μg/ml（3.58 mM）和400μg/ml（7.16 mM）。灌注8種鐵源，分別為：無機(jī)硫酸亞鐵、無機(jī)硫酸亞鐵與蛋氨酸混合物、無機(jī)硫酸亞鐵與甘氨酸混合物、蛋氨酸鐵、甘氨酸鐵

18、、弱絡(luò)合強(qiáng)度蛋氨酸鐵（Fe-Met W, Qf=1.37）、中等絡(luò)合強(qiáng)度的蛋白鐵（Fe-Prot M, Qf=43.6）和極強(qiáng)螯合強(qiáng)度的蛋白鐵（Fe-Prot ES, Qf=8,590）。選用160只28日齡鐵缺乏的商品代AA肉公雞，按體重隨機(jī)分為16個(gè)處理組（每個(gè)處理組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只雞），分別以上述鐵源灌注不同濃度的鐵，于灌注后30 min采樣。
　　結(jié)果表明：
　　1）灌注液鐵濃度為400μg/ml時(shí)肉雞小腸中

19、的鐵吸收率高于（P<0.0001）灌注液鐵濃度為200μg/ml時(shí)肉雞小腸中的鐵吸收率，十二指腸中的鐵吸收率顯著高于（P<0.003）空腸和回腸，空腸和回腸之間鐵吸收率無顯著差異（P>0.10），進(jìn)一步證明十二指腸是肉仔雞小腸鐵吸收的主要部位；
　　2）鐵源影響肉仔雞小腸段中的鐵吸收率（P<0.0001），無機(jī)硫酸鐵與蛋氨酸或甘氨酸混合組鐵的吸收率與甘氨酸鐵組和蛋氨酸鐵組近似（P>0.05），有高于硫酸亞鐵的趨勢(shì)（P=0.10和0

20、.02）。中等和極強(qiáng)絡(luò)（螯）合強(qiáng)度組的鐵吸收顯著高于（P<0.01）無機(jī)硫酸亞鐵組。無機(jī)硫酸亞鐵與蛋氨酸混合物組、無機(jī)硫酸亞鐵與甘氨酸混合物組、蛋氨酸鐵組、甘氨酸鐵組、弱絡(luò)合強(qiáng)度的蛋氨酸鐵組之間鐵吸收率差異不顯著（P>0.05）。中等絡(luò)合強(qiáng)度組與極強(qiáng)螯合強(qiáng)度組之間沒有差異（P>0.05）。從數(shù)值上看，各處理組鐵吸收率由高到低為：極強(qiáng)螯合強(qiáng)度的蛋白鐵組>中等絡(luò)合強(qiáng)度的蛋白鐵組>蛋氨酸鐵組>甘氨酸鐵組>無機(jī)硫酸亞鐵與甘氨酸混合物組>無機(jī)硫酸

21、亞鐵與蛋氨酸混合物組>弱絡(luò)合強(qiáng)度的蛋氨酸鐵組>無機(jī)硫酸亞鐵組。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，十二指腸是肉仔雞小腸鐵的主要吸收部位；有機(jī)鐵的吸收優(yōu)于無機(jī)鐵，且與其Qf值密切相關(guān)，其中以極強(qiáng)螯合強(qiáng)度有機(jī)鐵的吸收最好，中等絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵次之，弱絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵的最差，與無機(jī)硫酸亞鐵的近似；將蛋氨酸及甘氨酸分別與硫酸亞鐵簡(jiǎn)單地混合，有促進(jìn)鐵吸收的趨勢(shì)，其吸收率與蛋氨酸鐵、甘氨酸鐵以及弱絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵的相近。
　　試驗(yàn)五用原位結(jié)扎灌注腸段法研究不同形態(tài)

22、鐵在肉仔雞小腸中吸收差異的機(jī)制
　　本試驗(yàn)在前面試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用原位結(jié)扎灌注腸段法，進(jìn)一步深入研究不同形態(tài)鐵在肉仔雞結(jié)扎十二指腸中的吸收動(dòng)力學(xué)模式，并探討其在肉仔雞小腸中吸收差異的機(jī)制。本試驗(yàn)采用4×5兩因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，取肉仔雞十二指腸灌注，灌注液中添加的4種鐵源分別為：無機(jī)硫酸亞鐵、弱絡(luò)合強(qiáng)度的蛋氨酸鐵（Fe-Met W,Qf=1.37）、中等絡(luò)合強(qiáng)度蛋白鐵（Fe-Prot M, Qf=43.6）和極強(qiáng)螯合強(qiáng)度蛋白鐵（Fe-

23、Prot ES, Qf=8,590）；灌注液中的鐵添加水平分別為50（0.89 mM）、100（1.78 mM）、200（3.56 mM）、400（7.12 mM）和800（14.33 mM）μg/ml。同時(shí)設(shè)置不添加鐵的空白對(duì)照組，共21個(gè)處理。選用210只28日齡鐵缺乏的商品代肉公雞，按體重隨機(jī)分為21個(gè)處理組（每個(gè)處理組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只雞），分別按上述灌注濃度灌注不同形態(tài)鐵，于灌注后30 min采樣。結(jié)果表明：1）鐵源影響

24、（P<0.0001）肉仔雞小腸鐵吸收速率。中等和極強(qiáng)絡(luò)（螯）合強(qiáng)度有機(jī)鐵的吸收速率高于（P<0.05）無機(jī)硫酸亞鐵，中等絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵和極強(qiáng)絡(luò)螯合強(qiáng)度有機(jī)鐵有機(jī)鐵之間，以及弱絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵與其他鐵源之間差異不顯著（P>0.05）；
　　2）對(duì)不同形態(tài)鐵吸收速率隨其添加水平的變化趨勢(shì)進(jìn)行非線性回歸擬合，發(fā)現(xiàn)肉仔雞十二指腸中不同形態(tài)鐵的吸收均為飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)過程。另外，中等絡(luò)合強(qiáng)度有機(jī)鐵的Jmax值>（P<0.05）極強(qiáng)螯有機(jī)鐵的Jma

25、x值>（P<0.05）弱絡(luò)（螯）合強(qiáng)度有機(jī)鐵及無機(jī)鐵的Jmax值。各鐵源的Km之間差異不顯著（P>0.05）；
　　3）與空白對(duì)照組相比，灌注液中添加不同形態(tài)鐵均抑制了肉仔雞十二指腸中 DMT1 mRNA表達(dá)約50%（P<0.0003），但提高其FPN1 mRNA表達(dá)水平約2-3倍（P<0.001）。但不同鐵源間的DMT1和FPN1 mRNA表達(dá)水平之間無顯著差異（P>0.14）；
　　4）灌注液中添加鐵源對(duì)十二指腸DMT1

26、和FPN1蛋白表達(dá)水平無顯著影響（P>0.20）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)鐵源絡(luò)（螯）合強(qiáng)度越大，鐵吸收越多，但在肉仔雞十二指腸中均以飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)方式吸收，DMT1和FPN1以外的載體可能參與了不同形態(tài)鐵的吸收。
　　綜上所述，24種有機(jī)鐵源的絡(luò)（螯）合強(qiáng)度（Qf值）等化學(xué)特性變異很大；21日齡肉仔雞肝臟和腎臟SDH mRNA表達(dá)水平是評(píng)價(jià)肉仔雞對(duì)不同形態(tài)鐵源生物學(xué)利用率的特異功能性敏感指標(biāo)；十二指腸是肉仔雞小腸鐵吸收主要部位；肉仔雞

27、十二指腸和空腸鐵吸收以飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)方式為主，回腸的鐵吸收以非飽和擴(kuò)散方式為主；有機(jī)鐵源對(duì)肉仔雞的相對(duì)生物學(xué)利用率及其小腸鐵吸收均與其Qf值密切相關(guān)，Qf值越大，其鐵吸收越多，鐵相對(duì)生物學(xué)利用率越高；肉仔雞十二指腸中除DMT1和FPN1以外的轉(zhuǎn)運(yùn)載體可能參與了不同形態(tài)鐵的吸收，尚有待進(jìn)一步研究。以上研究新成果對(duì)于我國(guó)肉雞生產(chǎn)中科學(xué)研制開發(fā)和應(yīng)用適宜絡(luò)（螯）合強(qiáng)度的新型高效有機(jī)鐵添加劑，以促進(jìn)肉雞健康和高效地生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)減少鐵排出對(duì)環(huán)境的