多殺性巴氏桿菌△rpoE突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、兔多殺性巴氏桿菌病是一種急性敗血性傳染病，感染兔群可引起大規(guī)模死亡，對(duì)全世界養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)室前期成功構(gòu)建多殺性巴氏桿菌△hfq突變株,對(duì)突變株和親本株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果表明缺失hfq會(huì)導(dǎo)致rpoE表達(dá)上調(diào)，而 rpoE是一種sigma因子，控制基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯，在維持細(xì)菌的生長(zhǎng)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起重要的作用，因此以 rpoE為研究對(duì)象。以 rpoE為目的基因，通過(guò)正向同源重組構(gòu)建△rpoE缺失株，并進(jìn)行生長(zhǎng)特

2、性、遺傳穩(wěn)定性、抗逆性、粘附性、致病性以及調(diào)控功能的研究，明確 rpoE基因是否為多殺性巴氏桿菌的毒力基因，探索RpoE與Hfq的相互作用，為多殺性巴氏桿菌減毒疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
　　本研究以C51-17基因組為模板，PCR擴(kuò)增rpoE基因的上下同源臂，將pUC-4K載體的KanR基因連在上下同源臂之間，共同連接到載體pBC-SK上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBC-SK-△rpoE，將其電轉(zhuǎn)入C51-17感受態(tài)細(xì)胞中，采用抗性篩選法篩選對(duì)K

3、anR和 CmS的菌株，用PCR進(jìn)行驗(yàn)證，成功構(gòu)建了△rpoE突變株。以純化的重組蛋白R(shí)poE免疫小鼠，制備血清作為一抗，Western blot對(duì)△rpoE突變株和親本株進(jìn)行分析，結(jié)果表明：構(gòu)建的△rpoE突變株中無(wú)RpoE的表達(dá)。通過(guò)生長(zhǎng)特性試驗(yàn)、遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)、抗逆性試驗(yàn)、粘附性試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)和與Hfq相互作用試驗(yàn)等研究△rpoE突變株的生物學(xué)特性，結(jié)果表明：通過(guò)每小時(shí)對(duì)OD600進(jìn)行監(jiān)測(cè)，突變株生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)曲線與親本株無(wú)差別

4、；每隔5代對(duì)突變株進(jìn)行 PCR驗(yàn)證，突變株具有較好的穩(wěn)定性；在高鹽和低溫條件下對(duì)突變株與親本株OD600進(jìn)行監(jiān)測(cè)，突變株生長(zhǎng)緩慢，與親本株差異顯著；突變株與親本株對(duì)DF-1和RK-13細(xì)胞的粘附性差別不大，但對(duì)兔源細(xì)胞粘附性強(qiáng)于禽源；分別以1×102 CFU、1×104 CFU和1×106 CFU對(duì)小鼠攻毒，其中突變株以1×102 CFU攻毒死亡率為20％，以1×104 CFU攻毒死亡率為40%，1×106 CFU攻毒死亡率為100%，

5、通過(guò)計(jì)算確定突變株的LD50為1.89×103 CFU，而親本株以1×102 CFU攻毒后小鼠2 d內(nèi)全部死亡，表明rpoE為多殺性巴氏桿菌中重要的毒力基因；通過(guò)pull down試驗(yàn)驗(yàn)證Hfq和RpoE在體外相互作用關(guān)系時(shí)二者反應(yīng)結(jié)果陰性，說(shuō)明在多殺性巴氏桿菌中二者之間可能間接調(diào)控或以蛋白-基因水平調(diào)控。
　　本研究利用正向重組技術(shù)成功獲得了△rpoE突變株，通過(guò)分析其致病性初步確定 rpoE為多殺性巴氏桿菌中的一種毒力基因，通