流產(chǎn)布魯菌pyk和ppdk基因缺失株的構建及其生物學特性分析.pdf

1、布魯菌是一種人畜共患病原菌，兼性胞內(nèi)寄生，革蘭氏染色呈陰性，感染后主要導致人的波狀熱和動物的流產(chǎn)。布魯菌缺少典型的毒力因子，如細胞溶素、外毒素、莢膜等，其致病性主要表現(xiàn)為入侵靶細胞并在胞內(nèi)長期存活的能力。近年來，胞內(nèi)菌的碳代謝與細菌毒力之間的關系成為研究的熱點，李斯特桿菌、志賀氏菌、結核桿菌等胞內(nèi)菌能夠通過調控自身代謝來適應胞內(nèi)惡劣的生存環(huán)境，如低pH，營養(yǎng)匱乏、氧化應激等，而目前對布魯菌碳代謝與毒力的關系知之甚少。
　　本實驗室

2、前期利用信號標簽隨機突變(STM)技術篩選到了兩個與布魯菌毒力相關的碳代謝基因，即丙酮酸激酶基因(pyk，locus tag BAB_RS24320)和丙酮酸磷酸雙激酶基因(ppdk，locus tag BAB_RS18420)。為了進一步研究pyk和ppdk基因功能，本研究利用同源重組方法構建了pyk和ppdk定向缺失株，通過比較基因缺失后布魯菌的生物學特性變化來研究基因的功能，其中對pyk缺失株的研究更加深入。
　　當pyk基

3、因缺失后，生長曲線結果顯示布魯菌生長速度減慢，尤其在營養(yǎng)條件匱乏的條件下，減慢的趨勢更加顯著；耐受性實驗結果顯示Δpyk缺失株對氧化劑的耐受能力降低，然而對低pH、大牛血清、多粘菌素B的耐受能力與野毒相當；胞內(nèi)存活實驗結果顯示Δpyk在巨噬細胞內(nèi)的存活能力降低，并利用免疫熒光實驗進一步揭示了Δpyk在巨噬細胞內(nèi)減弱排斥溶酶體降解的能力；動物實驗結果顯示Δpyk缺失株不能在小鼠體內(nèi)建立慢性感染，這與Δpyk缺失株胞內(nèi)存活能力減弱是密切相關

4、的，表明pyk基因確實與布魯菌的毒力密切相關。當ppdk缺失后，生長曲線結果顯示布魯菌生長速度減慢；耐受實驗結果顯示Δppdk對多粘菌素B和大牛血清的耐受能力降低，然而對雙氧水耐受能力同野毒相當；胞內(nèi)存活實驗結果顯示在巨噬細胞內(nèi)的存活能力降低，同動物實驗中Δppdk對小鼠的致病力減弱的結果相符，表明ppdk基因也與布魯菌毒力密切相關。
　　綜上，本研究通過構建布魯菌碳代謝相關的Δpyk和Δppdk定向突變株，并測定缺失株主要的生物