HP CagA和雄激素受體AR參與胃癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：腫瘤的發(fā)生主要是多因素、多步驟導(dǎo)致的表觀遺傳學(xué)或遺傳學(xué)調(diào)控紊亂的結(jié)果。甲基化異常是腫瘤最重要的表觀遺傳學(xué)改變，抑癌基因異常高甲基化可導(dǎo)致基因沉默進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，最近研究表明，作為胃癌的I類致癌物，幽門螺桿菌（HP）尤其是CagA+ HP與胃癌相關(guān)抑癌基因的異常甲基化顯著相關(guān)，但其調(diào)控甲基化的具體機(jī)制仍不清楚，另外，HP引起的慢性炎癥以及腫瘤炎性微環(huán)境均會(huì)激活雄激素受體（AR），AR在胃癌中的作用及其機(jī)制目前也不清楚。

2、為此，本文擬探究HP在胃癌相關(guān)抑癌基因異常甲基化以及AR在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其具體機(jī)制。
　　方法：本研究用免疫組化(IHC)、蛋白免疫印跡(WB)和甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)O~6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）的甲基化程度、表達(dá)改變并分析其與臨床病理參數(shù)之間的聯(lián)系；用快速尿素酶試驗(yàn)（RUT）、Giemsa染色和RT-PC R檢測(cè)HP感染和CagA表達(dá)；用WB和免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）檢測(cè)相關(guān)通路蛋白表達(dá)；用免

3、疫熒光（IF）和免疫共沉淀(Co-IP)檢測(cè)蛋白之間相互作用；用雙熒光素酶和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)檢測(cè)蛋白與基因啟動(dòng)子區(qū)域相互作用；用小干擾RN As（siRNAs）和蛋白抑制劑干擾蛋白的表達(dá)或功能。另外，本研究用IHC和WB檢測(cè)AR在胃癌組織的表達(dá)并分析其與臨床病理特征之間的聯(lián)系，用CCK8（Cell Cou nting Kit）試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、Transwell試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)研究AR在胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移中的作用，WB檢測(cè)

4、CagA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中AR的表達(dá)，用IHC和WB檢測(cè)相關(guān)通路蛋白的表達(dá)，用雙熒光素酶試驗(yàn)和ChIP試驗(yàn)驗(yàn)證AR的靶基因，用siR NAs或蛋白抑制劑反向驗(yàn)證目的基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果：本研究表明，MGMT的甲基化程度、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）表達(dá)和CagA正相關(guān)；CagA通過增強(qiáng)3-磷酸肌醇依賴蛋白激酶1（PDK1）和AKT相互作用促進(jìn)AKT磷酸化；磷酸化的AKT激活NFκB；NFκB通過結(jié)合于DMMT1啟動(dòng)

5、子區(qū)域上調(diào)其表達(dá)；高表達(dá)的DNMT1導(dǎo)致抑癌基因MGMT啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化。另外，研究表明，AR的高表達(dá)和胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較晚的TNM分期正相關(guān)；CagA介導(dǎo)的高表達(dá)的P-AKT可以促進(jìn)AR的表達(dá)；AR高表達(dá)胃癌組織伴隨著AKT激活增加和MMP9表達(dá)上調(diào)；體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)AR表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲，該作用在AR、AKT或MMP9抑制后被逆轉(zhuǎn)；AR過表達(dá)可促進(jìn)MMP9上調(diào)，干擾AR表達(dá)后該作用被逆轉(zhuǎn)；用siRNAs或蛋白

6、抑制劑干擾AKT表達(dá)或阻斷其功能后，AR表達(dá)明顯減少；而AR抑制后并未影響AKT表達(dá)或活化。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)和ChIP表明AR可結(jié)合到MMP9啟動(dòng)子區(qū)域上調(diào)其表達(dá)；由此表明，磷酸化AKT可上調(diào)AR表達(dá)，AR進(jìn)而結(jié)合于MMP9啟動(dòng)子區(qū)域上調(diào)其表達(dá)參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論：幽門螺桿菌CagA通過PDK1/AKT-NFκB-DNMT1通路促進(jìn)抑癌基因高甲基化參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。另外，AR通過AKT-AR-MMP9通路在胃癌的