鈣敏感受體在胃癌發(fā)生發(fā)展和十二指腸HCO3-分泌中的作用及其機制研究.pdf

1、目的:
　　鈣是細胞內(nèi)重要的第二信使，參與了眾多病理生理過程的調(diào)控。G蛋白偶聯(lián)受體C家族的鈣敏感受體(CaSR)作為體內(nèi)鈣平衡重要的調(diào)節(jié)器，在整個消化系統(tǒng)均有表達，并且也在胃腸道生理功能和疾病進程中扮演著重要角色。目前有研究報道CaSR能通過鈣信號途徑影響胃酸、胰島素分泌及營養(yǎng)吸收等生理過程;而高鈣飲食可以激活CaSR，不但能抑制結(jié)腸癌的發(fā)展，還可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性;同時CaSR也在治療腹瀉疾病和結(jié)石相關性胰腺炎中具

2、有潛在的調(diào)控作用。然而CaSR在胃腸道的功能及調(diào)控機制仍有很多盲區(qū)。眾所周知消胃腸道腫瘤及消化性潰瘍都是消化系統(tǒng)常見病。胃腸道腫瘤發(fā)病率高，且侵襲、轉(zhuǎn)移能力強，多年來人們一直致力消化系統(tǒng)腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化以及后期浸潤、轉(zhuǎn)移的機制研究，但仍有許多問題仍不十分清楚;而消化性潰瘍的復發(fā)與遷延不愈同樣也是臨床上治療的一個難點。既往研究證實CaSR在不同的腫瘤中作用不同，而消化系統(tǒng)中僅在大腸癌中報道其作為抑癌因素，同時CaSR對胰腺碳酸氫鹽(HCO

3、3-)分泌的促進作用提示其可能也參與了十二指腸粘膜屏障的維護，因此本研究希望從消化生理和病理兩方面，探討鈣敏感受體及其下游的鈣信號通路在胃癌發(fā)生發(fā)展及十二指腸碳酸氫鹽分泌中的作用及其相關機制，為以鈣敏感受體及離子通道為靶點的藥物研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分:鈣敏感受體(CaSR)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究
　　1、采用Real-time PCR、免疫組化及Western-blot技術(shù)檢測胃

4、癌及癌旁組織、正常胃粘膜永生化細胞系及胃癌細胞系中CaSR的表達，分析統(tǒng)計CaSR表達水平和臨床分期、分型、血鈣水平及預后的相關性;
　　2、采用CCK8增殖測定實驗、細胞平面劃痕實驗，Transwell小室侵襲實驗以及裸鼠皮下成瘤實驗從體內(nèi)外水平共同驗證CaSR對胃癌細胞行為影響;
　　3、動態(tài)離子測定成像系統(tǒng)檢測正常胃粘膜永生細胞與胃癌細胞CaSR活化后調(diào)控細胞內(nèi)Ca2+及胃酸H+分泌能力的差異，從功能角度揭示CaSR從

5、正常向胃癌發(fā)展中的角色轉(zhuǎn)變;
　　4、Western-bolt技術(shù)檢測正常胃粘膜永生細胞與胃癌細胞CaSR活化后下游相關信號通路變化的差異，篩選最為重要的信號通路及靶基因。
　　第二部分:鈣敏感受體(CaSR)通過Ca2+調(diào)控途徑促進十二指腸離子轉(zhuǎn)運及HCO3-分泌的研究
　　1、Western-blot和免疫組化技術(shù)檢測CaSR在小鼠十二指腸組織及細胞系的表達及分布情況;
　　2、動態(tài)離子測定系統(tǒng)檢測CaSR對

6、十二指腸上皮細胞內(nèi)Ca2+變化及HCO3-分泌的影響;
　　3、通過各種離子通道抑制劑從細胞水平驗證參與CaSR調(diào)控HCO3-分泌的功能機制及下游相關通路。
　　結(jié)果:
　　第一部分:鈣敏感受體(CaSR)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究
　　1、Western-blot，Real-time PCR和免疫組化結(jié)果證實CaSR在胃癌組織和胃癌細胞系中的表達明顯高于癌旁組織和正常胃粘膜永生化細胞系，并且CaSR的表

7、達量與胃癌大小和分化程度、分期均有相關性（p＜0.05）;
　　2、臨床資料統(tǒng)計胃癌病人血液中的鈣離子濃度與CaSR蛋白表達量呈正相關，生存分析表明CaSR低表達組的胃癌患者術(shù)后生存時間優(yōu)于CaSR高表達組（p＜0.01），提示CaSR與胃癌病人的預后呈負相關性;
　　3、激活CaSR能促進胃癌細胞MKN45、SGC-7901的增殖、遷移及侵襲能力(P＜0.05)，并且這種促癌能力與CaSR的表達水平呈正相關。雖然CaSR對

8、正常胃粘膜永生細胞GES-1細胞也有一定的促遷移作用，但對增殖無明顯影響，CaSR的抑制劑NPS2143及CaSR shRNA能逆轉(zhuǎn)CaSR對胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的促進作用(p＜0.05);
　　4、裸鼠皮下成瘤實驗證實CaCl2瘤內(nèi)注射激活CaSR，可以促進裸鼠皮下腫瘤的生長，而CaSR抑制劑NPS2143能夠阻斷CaSR的促成瘤作用（p＜0.05）;
　　5、功能機制研究發(fā)現(xiàn)GES-1正常胃粘膜永生細胞、MKN45及

9、SGC-7901胃癌細胞的CaSR均能調(diào)控細胞內(nèi)鈣增加，并且胃癌細胞MKN45及SGC-7901細胞內(nèi)鈣升高的幅度較正常胃粘膜永生細胞GES-1明顯上升，提示正常細胞與癌細胞之間CaSR的鈣調(diào)控能力及途徑存在差異(p＜0.001); CaSR抑制劑NPS2143及CaSR shRNA能阻斷MKN45胃癌細胞CaSR活化引起的細胞內(nèi)鈣變化（p＜0.05）;
　　6、無外鈣環(huán)境中CaSR的活化并不能引起細胞內(nèi)鈣變化，必須在有鈣環(huán)境中C

10、aSR才能調(diào)控細胞內(nèi)鈣水平，膜上鈣通道阻斷劑2-APB和PLC途徑阻斷劑均能完全阻斷CaSR對細胞內(nèi)鈣的影響，提示參與CaSR調(diào)控胃癌細胞內(nèi)鈣增加的主要機制是外鈣內(nèi)流途徑（p＜0.05）;
　　7、分子機制研究證實，同時激活GES-1正常胃粘膜永生細胞和MKN45、SGC-7901胃癌細胞的CaSR，下游MAPK(ERK1/2/JNK)信號通路均在5-10min明顯活化，但PI3K/AKT和Wnt/β-catenin通路的變化卻出

11、現(xiàn)了差異， GES-1細胞的PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號通路被逐漸抑制，而MKN45、SGC-7901細胞卻明顯活化，提示正常細胞與癌細胞之間上述兩條通路的變化存在差異，并且可能與細胞內(nèi)鈣變化幅度的不同相關;
　　8、細胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM能完全阻斷CaSR對PI3K/AKT和Wnt/β-catenin以及MAPK信號通路的活化作用，提示Ca2+信號的確是精確調(diào)控上述通路的關鍵因素;PI3K/AKT、W

12、nt/β-catenin的抑制劑和細胞內(nèi)鈣螯合劑BAPTA-AM均能逆轉(zhuǎn)CaSR促進胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的能力;
　　第二部分:鈣敏感受體(CaSR)通過Ca2+調(diào)控途徑促進十二指腸離子轉(zhuǎn)運及HCO3-分泌的研究
　　1、免疫組化及蛋白免疫印跡實驗證實C57BL/6小鼠十二指腸組織、狗的十二指腸上皮細胞SCBN以及人的大腸癌細胞SW480、Caco-2均有CaSR表達，十二指腸組織主要在絨毛上皮頂端及基底部廣泛表達，進一

13、步亞細胞定位是在細胞的胞漿、胞膜區(qū)域;
　　2、功能實驗發(fā)現(xiàn)十二指腸上皮細胞SCBN的CaSR能夠調(diào)控細胞內(nèi)鈣增加，并且增加的幅度與激動劑的刺激濃度呈劑量依賴性(p＜0.01）。CaSR阻斷劑Calhex后能明顯阻斷CaSR介導的細胞內(nèi)鈣變化(p＜0.05）;
　　3、無外鈣環(huán)境中激活SCBN細胞的CaSR并不能引起細胞內(nèi)鈣增加，必須在有鈣環(huán)境中CaSR才能調(diào)控細胞內(nèi)鈣水平，膜上鈣通道阻斷劑2-APB和SKF能完全阻斷CaS

14、R對SCBN細胞內(nèi)鈣的影響，提示CaSR對SCBN細胞的鈣調(diào)控機制是通過外鈣內(nèi)流途徑是(p＜0.05);
　　4、進一步單細胞HCO3-動態(tài)測定實驗發(fā)現(xiàn)SCBN細胞的CaSR可以通過影響細胞內(nèi)鈣變化，調(diào)控HCO3-分泌通道CFTR的開放促進了HCO3-的跨膜流動，CFTR阻斷劑CFTR-173及膜上Ca2+通道阻斷劑2-APB均能阻斷CaSR對HCO3-跨膜流動的促進作用（p＜0.01）;
　　5、動物體內(nèi)實驗結(jié)果提示CaS

15、R的活化對CFTR野生型小鼠的十二指腸粘膜HCO3-分泌具有促進作用(p＜0.01)，但對CFTR敲除小鼠HCO3-的分泌沒有影響，另外對代表Cl-通道活性的Isc值也沒有調(diào)控作用(p＞0.05); PLC-Ca2+途經(jīng)抑制劑U73122可以明顯阻斷CaSR對CFTR野生型小鼠HCO3-的促分泌作用（p＜0.01）;
　　結(jié)論:
　　1、本研究首次證實了CaSR在胃癌發(fā)生發(fā)展中的促癌作用及其相關機制，CaSR通過膜上鈣通道介

16、導了胃癌細胞內(nèi)鈣的增加，進而激活下游的PI3K/AKT和3-catenin信號通路促進胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力。并且CaSR的表達水平及其介導的細胞內(nèi)鈣變化幅度是調(diào)控胃癌細胞行為及其下游信號通路活化差異的重要因素。我們的結(jié)果不僅為臨床上高鈣血癥的不良預后給出了可能的解釋，同時也為低鈣補液、低鈣飲食防治胃癌的理論和以CaSR為靶點的藥物研發(fā)提供實驗依據(jù);
　　2、我們生理功能的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaSR具有促進十二指腸HCO3-的分

17、泌、幫助粘液屏障構(gòu)建的重要作用。十二指腸上皮細胞的CaSR通過鈣調(diào)控途徑，不僅激活了HCO3-分泌通道CFTR，同時還活化了為HCO3-分泌提供驅(qū)動力IKCa（Ca2+激活鉀通道）通道共同促進HCO3-的分泌，而Cl-通道沒有受CaSR/Ca2+途徑的調(diào)控，推測十二指腸上皮HCO3-與Cl-的分泌存在不同的調(diào)節(jié)機制。該研究不僅有助于治療囊性纖維化病人HCO3-的分泌缺失，還可能為以CaSR和離子通道為靶點的粘膜屏障促進藥物提供一定的理論