結(jié)核Rv1246c-Rv1247c基因重組恥垢分枝桿菌及其編碼蛋白功能的初步研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種慢性傳染病，已困擾人類數(shù)千年。盡管目前的正規(guī)聯(lián)合治療方案 (DOTS)取得良好的效果，但與其他感染性疾病相比，該病的治療存在病程遷延、易復(fù)發(fā)的問題。資料表明全球大約有1/3的人口具有結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染，隨著社會老齡化、HIV感染和耐藥菌株的流行，這一問題日漸突出，成為人類防治結(jié)核病的重要“瓶頸問題”。結(jié)核分枝桿菌的持留狀態(tài)或稱持留菌(My

2、cobacterial tuberculosis persister)被認(rèn)為是結(jié)核病病程遷延、復(fù)發(fā)的根本原因。因此，探索MTB長期持留的分子機制，尋找抗結(jié)核潛伏感染的有效途徑將為人類戰(zhàn)勝結(jié)核病帶來新的希望。 目前關(guān)于結(jié)核分枝桿菌持留狀態(tài)的分子生物學(xué)機制眾說紛紜。近年在原核生物染色體基因組上廣泛存在被認(rèn)為參與原核生物基因表達(dá)質(zhì)量控制的 TA 系統(tǒng) (Toxin-antitoxin model)可能與細(xì)菌在壓力因素下的長期存活密切相

3、關(guān)。Gerdes等通過比較基因組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)在結(jié)核桿菌 H37Rv株中含有38個TA loci，其中包括3個relBE位點。但關(guān)于這些基因在結(jié)核分枝桿菌中的生物學(xué)意義國內(nèi)外鮮見報道。因此對這些未知功能的假想蛋白基因進(jìn)行研究不僅對結(jié)核分枝桿菌后基因組學(xué)的研究增添實驗資料，而且可能對深入認(rèn)識、理解結(jié)核桿菌持留狀態(tài)的分子生物機制提供新的研究方向。 本研究在文獻(xiàn)資料和生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上以結(jié)核桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，首次對結(jié)

4、核分枝桿菌Rvl246c和Rvl247c基因進(jìn)行克隆和融合表達(dá)，并構(gòu)建了pMV-relBE(含Rvl246c-Rvl247c重疊基因)大腸桿菌一分枝桿菌重組表達(dá)穿梭質(zhì)粒，用電穿孔方法將該質(zhì)粒導(dǎo)入快速生長型非致病性恥垢分枝桿菌mc<'2>155株，并對該重組菌在體外壓力環(huán)境和巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活情況及對巨噬細(xì)胞功能影響進(jìn)行實驗研究，初步探索目的基因在菌體存活、繁殖速率以及抵抗體內(nèi)外環(huán)境壓力等方面的功能；同時利用酵母雙雜交系統(tǒng)，在酵母細(xì)胞體內(nèi)觀

5、察 RVl246c-Rvl247c 基因編碼假想蛋白間的相互作用，為研究該對基因是否具有TA系統(tǒng)抗毒素一毒素通用模式提供實驗依據(jù)。 以重組恥垢分枝桿菌MCBE(負(fù)載Rvl246c-R-V1247c重疊基因)和 MC261 (負(fù)載pMV261空質(zhì)粒)為實驗對象，在體外營養(yǎng)豐富，培養(yǎng)條件適宜的環(huán)境下監(jiān)測細(xì)菌的生長曲線，表明二者增殖特性相似，外源基因在該條件下不影響正常恥垢分枝桿菌的生長。在與上述相同培養(yǎng)條件下分別施加不同時間的熱壓力

6、(53℃)和酸壓力(pH 4．0)，通過對不同壓力時間處理后細(xì)菌CFU (克隆形成單位)變化的統(tǒng)計分析，推測結(jié)核 RVl246c-Rvl247c基因具有在體外壓力環(huán)境中使菌體增殖延緩、通過調(diào)整菌體生長代謝狀態(tài)以對抗環(huán)境壓力的分子功能。感染小鼠ANA-1巨噬細(xì)胞的實驗表明：與對照組相比較，負(fù)載Rvl246c-Rvl247c重疊基因的重組恥垢分枝桿菌MCBE．感染巨噬細(xì)胞后其胞內(nèi)繁殖速度較緩慢，且表現(xiàn)為觸發(fā)感染細(xì)胞凋亡的能力較弱及刺激細(xì)胞明

7、顯活化反應(yīng)相對遲緩的現(xiàn)象。酵母雙雜交實驗表明結(jié)核Rvl246c和Rvl247c基因編碼的假想蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)可以相互作用，推測二者具有TA系統(tǒng)抗毒素一毒素蛋白共同的胞內(nèi)天然復(fù)合體形式。 綜上所述，本研究從生物信息學(xué)角度推測結(jié)核分枝桿菌Rvl246c和 Rvl247c基因編碼的假想蛋白屬于原核生物TA系統(tǒng)relBE家族；構(gòu)建能夠表達(dá)Rvl246c和Rvl247c基因編碼假想保守蛋白的重組恥垢分枝桿菌能較對照組更易對抗體內(nèi)外壓力及抵