能量狀態(tài)介導(dǎo)的mTOR信號通路在大鼠大范圍肝切除術(shù)后肝功能衰竭中的作用研究.pdf

1、背景和目的：
　　肝切除術(shù)是治療肝臟良惡性腫瘤的首選方法。隨著圍手術(shù)期管理水平的不斷提高、手術(shù)技術(shù)的不斷進步，尤其是精準外科理念的不斷深入，肝切除術(shù)的手術(shù)適應(yīng)證及切除范圍不斷擴大，以往認為無法切除的肝臟巨大腫瘤、多發(fā)腫瘤以及肝門區(qū)腫瘤在今天得以切除，使患者長期無瘤生存成為可能。然而，盡管擴大切除范圍能夠完整的切除腫瘤并獲得陰性切緣，但大范圍切除術(shù)后由于預(yù)留的功能性肝體積不足，常常導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭的發(fā)生，這是患者術(shù)后死亡的主要原因

2、，嚴重限制了大范圍肝切除在臨床的應(yīng)用。
　　盡管大范圍肝切除術(shù)后肝功能衰竭是一種嚴重的臨床綜合征，但其具體的病理生理機制仍未完全明了。術(shù)后肝衰發(fā)生的本質(zhì)在于殘余肝臟再生與損傷的不協(xié)調(diào)導(dǎo)致的功能性肝細胞簇數(shù)量不足。門脈高灌注、Kupffer細胞激活、腸道菌群異位、過度的炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)是造成實質(zhì)損傷的主要原因，對于這些因素進行相應(yīng)的干預(yù)能在一定程度上改善大范圍肝切除術(shù)的預(yù)后。然而殘余肝臟的再生在術(shù)后肝衰的病理生理過程中所起的

3、作用，目前研究尚未達成統(tǒng)一觀點。有些研究認為，由于實質(zhì)細胞與非實質(zhì)細胞的再生進程不同步，大范圍肝切除術(shù)后早期過快的肝再生反而促進門脈壓力的進一步升高，無益于殘余肝臟組織結(jié)構(gòu)的重建。但是另有研究也發(fā)現(xiàn)大范圍肝切除術(shù)后殘余肝臟的再生表現(xiàn)為明顯抑制，同時，促進肝再生的措施也能顯著提高術(shù)后生存率。因此，明確殘余肝臟組織再生進程的變化，對于進一步認識大范圍肝切除術(shù)后肝功能衰竭的病理生理機制及發(fā)掘潛在的治療策略意義重大。
　　肝切除術(shù)后殘余肝

4、臟的再生是受到精確調(diào)控的復(fù)雜生理過程，細胞因子、生長因子及代謝產(chǎn)物共同構(gòu)成肝再生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。肝臟是機體的代謝中樞，肝切除術(shù)后殘余肝臟組織一方面要維持肝臟特異性功能，如糖異生、尿素合成等，另一方面也要產(chǎn)生大量ATP，不僅用于蛋白、核酸及其他細胞成分的合成，也參與重要的再生相關(guān)信號通路的活化。肝切除術(shù)會嚴重影響肝臟的代謝功能，尤其是能量代謝。因此，能量代謝的異?？赡芡ㄟ^再生進程的調(diào)控參與術(shù)后肝衰的病理生理過程。
　　mTOR信號通路通

5、過整合胞內(nèi)能量狀態(tài)、氧含量以及胞外生長因子、營養(yǎng)物質(zhì)等信息，調(diào)控細胞的代謝以及生長增殖過程。當能量及營養(yǎng)物質(zhì)來源充足時，該信號通路能夠促進細胞的生長;反之，在能量狀態(tài)低下的情況下，細胞轉(zhuǎn)向能量恢復(fù)的過程。
　　基于以上認識，我們設(shè)想大范圍肝切除術(shù)后由于剩余肝臟組織代謝功能的紊亂導(dǎo)致能量狀態(tài)的顯著低下，可能干擾了mTOR信號通路，繼而抑制殘余肝臟細胞的再生，導(dǎo)致或者促進肝功能衰竭的發(fā)生。
　　本課題擬通過建立不同范圍肝切除的大

6、鼠模型，研究不同范圍肝切除術(shù)，尤其是90％肝切除術(shù)后殘余肝臟的再生與損傷改變，探討能量代謝對mTOR信號通路以及殘余肝臟再生的影響及機制;以及改善能量狀態(tài)對大范圍肝切除術(shù)后肝再生的影響。為臨床改善大范圍肝切除術(shù)后患者的肝功能和預(yù)后，提高肝臟腫瘤的手術(shù)切除率提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　本課題實驗分三部分進行:
　　第一部分:基于精準外科理念，建立不同范圍肝切除的大鼠模型，初步觀察術(shù)后肝功能、血生化及組織病理學變化和術(shù)

7、后肝衰的發(fā)生率及死亡率，選出合適的大范圍肝切除術(shù)后肝功能衰竭的標準化模型。
　　第二部分:將大鼠分為假手術(shù)組、85％肝切除組（大范圍肝切除無肝功能衰竭組）和90％肝切除組（大范圍肝切除肝功能衰竭組）。對比85％肝切除組和90％肝切除組術(shù)后生存率、肝功能、肝再生及實質(zhì)損傷的相關(guān)指標的變化。檢測mTOR信號通路活性在兩組的差異。
　　第三部分:進一步檢測mTOR信號通路的上下游分子的活性在85％和90％肝切除組的差異。用代謝組學

8、的方法探討90％肝切除術(shù)后大鼠全身代謝水平的改變。我們選擇葡萄糖作為治療組干預(yù)藥物，探討改善能量狀態(tài)對90％肝切除術(shù)后mTOR信號通路及殘余肝臟再生和預(yù)后的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分:成功建立了大鼠不同范圍肝切除的標準化模型。與其它組相比，90％肝切除術(shù)后大鼠肝功能障礙更加明顯，表現(xiàn)為血清ALT、AST、TBIL水平的明顯升高，ALB水平明顯降低。70％和85％肝切除術(shù)后大鼠的生存率均為100％，而90％肝切除術(shù)的生存

9、率明顯降低，僅為23％。對死亡大鼠進行尸檢，見腹腔內(nèi)少量至中等量淡黃色腹水，尾葉腫脹，表面顏色略有蒼白，并可見擴張血管，未發(fā)現(xiàn)出血、膽漏、腔靜脈狹窄等并發(fā)癥，證實死于肝功能衰竭。病理學檢測發(fā)現(xiàn)肝切除術(shù)后24小時殘余肝臟表現(xiàn)為肝小葉基本結(jié)構(gòu)存在，肝血竇擁塞，肝細胞表現(xiàn)為明顯的空泡樣變，但在70％、85％和90％肝切除組之間未發(fā)現(xiàn)明顯的差異，同時，三組也未出現(xiàn)明顯的肝細胞壞死表現(xiàn)。
　　第二部分:1.與假手術(shù)組相比，85％肝切除組與9

10、0％肝切除組術(shù)后大鼠血清ALT、AST水平及HMGB-1的mRNA水平均顯著升高，但兩組之間的差異無統(tǒng)計學意義;組織病理學檢測顯示術(shù)后24小時兩組殘余肝葉組織肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細胞空泡變明顯，無炎性細胞浸潤、壞死等病理改變，中性粒細胞標志物-MPO染色進一步證實兩組無明顯的中性粒細胞浸潤;TUNEL染色顯示兩組僅有少量TUNEL陽性細胞，Western blot結(jié)果顯示caspase-3蛋白表達在兩組之間無差異。2.與假手術(shù)組相比，

11、85％肝切除組與90％肝切除組術(shù)后殘肝都表現(xiàn)出明顯的再生反應(yīng)，但后者的再生率明顯低于前者，術(shù)后24小時有絲分裂指數(shù)表現(xiàn)出相同的趨勢;肝組織再生相關(guān)因子的mRNA表達情況:TNF-α、myc和HGF的mRNA表達在兩組之間無明顯差異，IL-6的mRNA表達水平在90％肝切除組明顯上調(diào);細胞周期相關(guān)因子(cyclin D、cyclin E、cyclinA、cyclin B)的mRNA的表達，在90％肝切除組明顯低于85％肝切除組;肝組織Ki

12、-67結(jié)果顯示，兩組術(shù)后均有不同程度的細胞增殖，且90％肝切除組的陽性率明顯低于85％肝切除組。肝組織PCNA蛋白的Westernblot結(jié)果顯示出類似的變化趨勢。3.Western blot檢測各組mTOR及其下游分子p70s6k、4EBP1的磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90％肝切除術(shù)后mTOR、p70s6k和4EBP1的磷酸化水平明顯下調(diào)，提示該通路的激活出現(xiàn)異常。
　　第三部分:1.Western blot結(jié)果顯示，與85％肝切除組

13、相比，90％肝切除組AMPKα的磷酸化水平明顯上調(diào)，而cyclin D蛋白的表達顯著降低。Akt的磷酸化水平兩組之間無明顯差異。磷鉬酸比色法檢測肝組織ATP含量，結(jié)果顯示:術(shù)后早期90％肝切除組殘余肝組織ATP含量明顯低于85％肝切除組。2.代謝組學結(jié)果顯示90％肝切除術(shù)嚴重干擾了大鼠的代謝，尤其是能量相關(guān)的代謝通路發(fā)生了明顯改變。3.葡萄糖干預(yù)顯著提高90％肝切除術(shù)后殘余肝組織ATP水平，殘余肝臟的再生率及有絲分裂指數(shù)顯著提高，組織病

14、理學檢測顯示Ki-67陽性率明顯升高，Western blot的結(jié)果PCNA、cyclin D的蛋白表達水平及mTOR信號通路活性明顯提高。
　　結(jié)論:
　　1.基于實驗室前期的工作，在充分了解大鼠肝臟及管道系統(tǒng)解剖的基礎(chǔ)上，規(guī)范手術(shù)步驟和方法，精確地處理大鼠肝臟實質(zhì)內(nèi)入肝血流及肝靜脈等重要結(jié)構(gòu)，成功建立了穩(wěn)定的不同范圍肝切除的標準化模型。
　　2.利用我們的方法建立的大鼠90％肝切除模型術(shù)后早期發(fā)生急性肝功能衰竭，表

15、現(xiàn)為肝臟排泄、合成及代謝功能的明顯障礙，死亡率高但有一定的自愈率等特點，能夠很好的模擬肝切除術(shù)后肝功能衰竭的臨床表現(xiàn)，是一個符合外科臨床實際的理想模型。
　　3.再生早期啟動因子的明顯上調(diào)說明90％肝切除誘導(dǎo)了強烈的再生信號，但細胞增殖周期相關(guān)因子的結(jié)果提示殘余肝臟并未表現(xiàn)出同樣強烈的增殖能力。殘余肝臟的再生抑制是導(dǎo)致90％肝切除術(shù)后肝功能衰竭的主要原因。
　　4.代謝組學的結(jié)果證實90％肝切除造成嚴重的代謝紊亂，嚴重影響了

16、能量的產(chǎn)生，表現(xiàn)為90％肝切除術(shù)后殘余肝臟的ATP含量的明顯降低。低能量狀態(tài)通過AMPK的激活抑制了mTOR信號通路，繼而造成殘余肝臟的再生抑制。
　　5.提高90％肝切除術(shù)后的能量狀態(tài)能夠促進殘余肝臟的再生，并延長大鼠術(shù)后生存時間及生存率，改善大范圍肝切除術(shù)的預(yù)后。
　　6.能量的產(chǎn)生涉及多個方面，比如線粒體是否能夠維持正常的氧化磷酸化及電子傳遞的功能，是否足量恰當?shù)哪芰看x底物的供應(yīng)等。因此需要進一步探討大范圍肝切除術(shù)后