抗肝癌單鏈抗體抑瘤效果的提高.pdf

1、制備單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，為腫瘤的治療提供了新的手段，即腫瘤的導(dǎo)向治療。本實驗室從事肝癌導(dǎo)向治療的研究已達20余年，應(yīng)用人新鮮肝癌細胞懸液制備的抗肝癌單克隆抗體HAb25，經(jīng)免疫組織化學(xué)和放射免疫顯像實驗證實特異性強，親合力高，具有良好的導(dǎo)向作用。此后，又分別克隆了抗肝癌單克隆抗體HAb25的VH和VL基因，通過連接肽(Gly4Ser)3相連制備了msFv25，經(jīng)二硫鍵穩(wěn)定和人源化改造獲得了抗肝癌hdsFv。近年來，本實驗室構(gòu)建并

2、表達了多種抗肝癌重組免疫毒素，如scFv25-TNFα，scFv25-突變型TNFα，hdsFv-突變型TNFα，hdsFv25-PE38和hdsFv25-RC-RNase等，經(jīng)對體外培養(yǎng)的肝癌細胞的MTT實驗及對荷肝癌裸鼠的抑瘤實驗表明均具有明確的導(dǎo)向作用，在對肝癌的治療中取得了良好的治療效果。 研究表明，核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)不僅具有催化活性，而且具有細胞毒性，有望成為一類新型的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨

3、床腫瘤的治療。細胞毒性RNase，尤其是來源于蛙類的RNase，它們分子量小，細胞毒性非常強，具有強大的選擇性殺傷腫瘤細胞的作用，很少對機體產(chǎn)生毒副作用。本實驗在付勇博士實驗的基礎(chǔ)上，將他構(gòu)建的牛蛙核糖核酸酶(RC-RNase)原核表達載體在大腸桿菌中進行表達及純化，使用免疫印跡法(Westernblotting)檢測其特異性和MTT法觀察其對體外培養(yǎng)的肝癌細胞具有一定的殺傷作用。MTT實驗結(jié)果表明，純化的目的蛋白對體外培養(yǎng)的肝癌細胞具

4、有一定的殺傷作用，其半抑制濃度(IC50)是22.44±1.35μg/mL。 根據(jù)蛙類核糖核酸酶的保守序列分析，設(shè)計合適的引物，從雌性中國陜西青蛙肝臟組織中提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法，分別擴增保守序列、3’-端和5’-端的基因片段。已成功擴增出保守序列和3’-端基因片段，5’-端已擴增出4個片段，但有待遇分析，然后克隆出中國陜西青蛙核糖核酸酶的新基因，企圖獲得細胞毒性更強、對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用更高的細胞毒素。

5、 單鏈抗體(singlechainantibody)介導(dǎo)的空間穩(wěn)定免疫脂質(zhì)體是近年來主動靶向制劑研究的重點之一。本文使用牛蛙核糖核酸酶和免疫毒素PE38為模型藥物，制備了牛蛙核糖核酸酶空間穩(wěn)定免疫脂質(zhì)體(RC-RNase-SIL[hdsFv25])和免疫毒素PE38空間穩(wěn)定免疫脂質(zhì)體(PE38-SIL[hdsFv25])。經(jīng)檢測其包封率分別是42.38±3.96％和38.56±1.29％。并將其分別對體外培養(yǎng)的SMMC-7721肝癌

6、細胞進行MTT實驗，結(jié)果如下： 免疫脂質(zhì)體RC-RNase、毒素RC-RNase和脂質(zhì)體RC-RNase的IC50值分別是：3.28±0.56μg/mL、22.44±1.35μg/mL和98.26±3.94μg/mL；免疫脂質(zhì)體PE38、免疫毒素PE38和脂質(zhì)體PE38的IC50值分別是：0.59±0.08μg/mL、6.04±0.86μg/mL和92.07±4.69μg/mL。 從上面結(jié)果看出，它們對肝癌細胞都有一定的