人和羊IgG誘導(dǎo)細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合分子單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體文庫不同的體外進(jìn)化結(jié)果.pdf

1、金黃色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal proteinA,SpA)和鏈球菌蛋白G(streptococcal proteinG,SpG)是細(xì)菌產(chǎn)生的特異結(jié)合宿主抗體的細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin(Ig)-bindingproteins,IBPs)的代表分子。SpA和SpG均包含由多個(gè)的序列高度同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域重復(fù)組成的抗體結(jié)合區(qū),各單結(jié)構(gòu)域都具有完全的結(jié)合IgG的功能。
　　本研究構(gòu)建了兩個(gè)由S

2、pA和SpG各單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組成的噬菌體展示文庫,通過人和羊IgG對這兩個(gè)文庫進(jìn)行親和篩選,以期能夠獲得對人和羊IgG具有特異優(yōu)勢結(jié)合能力的組合分子。使用PCR擴(kuò)增法制備SPA(A、B、C、E)、SPG(B2、B3)以及SPA(A、B、D、E)、SPG(B2、B3)各結(jié)構(gòu)域核苷酸片段,在片段兩端通過引物引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基,同時(shí)在3’端引入3個(gè)氨基酸大小的隨機(jī)連接肽核苷酸序列,經(jīng)XbaⅠ酶消化各結(jié)構(gòu)域核苷酸片段,在LH連接酶作用

3、下隨機(jī)相互連接并克隆于噬菌粒載體pCANTAB5S,并轉(zhuǎn)化TG1細(xì)胞,經(jīng)M13K07輔助噬菌體拯救,得到Ig結(jié)合分子單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體展示文庫。用人和羊IgG同時(shí)對兩個(gè)文庫進(jìn)行親和篩選,每一輪篩選后均隨機(jī)挑選單克隆進(jìn)行PCR鑒定,檢測片段插入的大小分布情況,以評價(jià)篩選有效性;同時(shí)對篩選后文庫中的單克隆進(jìn)行序列測定,獲得展示序列終單結(jié)構(gòu)域的排列組合情況。篩選結(jié)果統(tǒng)一后,制備最終得到的各特異優(yōu)勢組合分子的單克隆噬菌體,通過噬菌體ELIS

4、A的方法來比較其與人和羊IgG的結(jié)合特性。
　　本研究成功構(gòu)建了噬菌體展示SpA(A、B、C、E)、SpGB2、B3)(庫C)以及SpA(A、B、D、E)、SpG(B2、B3)(庫D)共六個(gè)單結(jié)合結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫。其中單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫庫C的庫容為8.5×106,噬菌體庫滴度為1.82×1012TU/Ml,PCR鑒定陽性片段插入率為78％(其中1個(gè)domain的組合占50%;2個(gè)domain的組合占16.7%;3個(gè)及3個(gè)以上d

5、omain的組合占8%);庫D的庫容為8.1×106,噬菌體庫滴度為1.69×1012TU/Ml,PCR鑒定陽性片段插入率為72%(1個(gè)domain的組合占40%;2個(gè)domain的組合占19.4%;3個(gè)及3個(gè)以上domain組合,占9.5%)。測序結(jié)果顯示,各單結(jié)構(gòu)域組合情況、正反向插入情況、連接肽均呈現(xiàn)隨機(jī)分布,所建文庫符合進(jìn)行體外進(jìn)化篩選要求。篩選最均獲得了SpA天然分子中不存在的單結(jié)構(gòu)域排列組合分子,庫C經(jīng)過人IgG誘導(dǎo)四輪篩選

6、后,片段大小統(tǒng)一為2個(gè)domain,測序分析后組合為A-C,庫C經(jīng)過羊IgG誘導(dǎo)六輪篩選后,片段大小統(tǒng)一為2個(gè)domain,測序分析后組合為A-B3。庫D經(jīng)過人IgG誘導(dǎo)六輪篩選后,片段大小統(tǒng)一為3個(gè)domain,測序分析后組合為E-B-B3,庫D經(jīng)過羊IgG誘導(dǎo)六輪篩選后,片段大小統(tǒng)一為4個(gè)domain,測序分析后組合為D-A-B3-B3。噬菌體ELISA進(jìn)一步證實(shí)庫C得到的組合分子A-C對人IgG的結(jié)合能力高于組合分子A-B3,而組

7、合分子A-C對羊IgG的結(jié)合能力低于于組合分子A-B3,與篩選結(jié)果完全吻合;然而,與庫C篩選結(jié)果不同的是,庫D得到的組合分子D-A-B3-B3對人和羊IgG的結(jié)合能力都高于組合分子E-B-B3,未顯示出抗體結(jié)合的特異性。
　　本研究成功使用人和羊IgG誘導(dǎo)細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合分子單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體文庫完成體外進(jìn)化篩選,分別獲得到了與人和羊IgG具有不同結(jié)合優(yōu)勢的新型組合分子A-C、A-B3、E-B-B3、D-A-B3-B3,其中