旁分泌或自分泌細(xì)胞因子在乳腺癌上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及耐藥和轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、目的：乳腺癌是女性中發(fā)病率最高、危害最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一。近年來，隨著治療手段的更新、治療方案的改進(jìn)及治療方式的多樣化，乳腺癌的臨床治療效果得到了很大改善，然而目前全世界每年仍有約50萬人死于乳腺癌。長(zhǎng)期研究表明:非手術(shù)治療耐受和手術(shù)前后的轉(zhuǎn)移是乳腺癌死亡的重要原因，乳腺癌治療耐受與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如耐藥乳腺癌更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移的乳腺癌更具藥物耐受性。但由于乳腺癌細(xì)胞和分子異質(zhì)性明顯，其非手術(shù)治療耐受及早期微轉(zhuǎn)移和晚期轉(zhuǎn)移機(jī)制，

2、尤其是耐受和轉(zhuǎn)移之間的內(nèi)在聯(lián)系一直未予闡明。晚近較多的文獻(xiàn)報(bào)道:乳腺癌發(fā)生發(fā)展和治療過程中出現(xiàn)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與其細(xì)胞轉(zhuǎn)移和耐藥表型發(fā)生均存關(guān)聯(lián)，較為一致的解釋是，EMT后的細(xì)胞粘附能力降低、易自原發(fā)灶脫落，且易穿過血管壁而遠(yuǎn)處遷移;同時(shí)EMT過程使乳腺癌干細(xì)胞得以富集，繼而增強(qiáng)細(xì)胞的藥物抗性、凋亡抗性及轉(zhuǎn)移能力?？梢?，乳腺癌EMT形成機(jī)制的闡述將可望闡述乳腺

3、癌耐藥、轉(zhuǎn)移機(jī)制以及二者內(nèi)在聯(lián)系的規(guī)律。腫瘤細(xì)胞EMT啟動(dòng)與腫瘤微環(huán)境的改變相關(guān)，腫瘤細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境變化時(shí)能自分泌或/和旁分泌一系列細(xì)胞因子來啟動(dòng)EMT進(jìn)程，不幸的是手術(shù)、放化療等均能引起微環(huán)境的改變，可見化療、放療在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT及耐藥和轉(zhuǎn)移。為了探討乳腺癌化療耐藥與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，一系列的細(xì)胞或動(dòng)物模型相繼建立，通過模型雖然鑒定了一系列的耐藥或轉(zhuǎn)移相關(guān)因子，但對(duì)這些因子的干預(yù)仍不能

4、很好的解釋或逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥或轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。隨著研究的深入，腫瘤微環(huán)境與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系已日益明確，而腫瘤微環(huán)境與腫瘤治療反應(yīng)或腫瘤耐藥之間的關(guān)系研究報(bào)道仍然甚少。本課題組前期建立了乳腺癌5-Fu耐藥細(xì)胞系MCF-7/5-Fu，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系不僅耐藥指數(shù)增高，還呈現(xiàn)典型的EMT形態(tài)特征;進(jìn)一步基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一系列EMT相關(guān)基因和細(xì)胞因子在耐藥細(xì)胞(MCF-7/5-Fu)和親代細(xì)胞(MCF-7)存在明顯的差異表達(dá)。本課題將在驗(yàn)證EMT相

5、關(guān)細(xì)胞因子TGFβ2在乳腺癌耐藥中的作用和調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)探討體外培養(yǎng)細(xì)胞微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT及耐藥和轉(zhuǎn)移的影響，篩選和鑒定參與調(diào)控的關(guān)鍵細(xì)胞因子，為闡述乳腺癌EMT及其在耐藥和轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制，乳腺癌耐藥和轉(zhuǎn)移的相互影響機(jī)制提供新的證據(jù);為篩選和鑒定乳腺癌耐藥和轉(zhuǎn)移新的標(biāo)志物，開發(fā)以標(biāo)志物為靶點(diǎn)的可望干預(yù)和逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥和轉(zhuǎn)移的新藥提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴通過miRNA芯片篩選MCF-7/5-Fu細(xì)胞中的差異表達(dá)miRN

6、As并用miRNA特異性qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)合生物信息學(xué)分析對(duì)接前期差異基因芯片結(jié)果以預(yù)測(cè)可能靶向調(diào)控TGFβ2的miRNAs;在8株乳腺癌細(xì)胞系中驗(yàn)證miRNAs與TGFβ2的相關(guān)關(guān)系;將兩個(gè)Copy miRNA前體克隆入pLEX-MCS慢病毒載體分別構(gòu)建miR-141、miR-200a和miR-145過表達(dá)的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，用經(jīng)293T細(xì)胞包裝后的病毒顆粒感染TGFβ2高表達(dá)而相應(yīng)miRNAs低表達(dá)的MCF-7/5-Fu、MDA-

7、MB-231和Hs578T細(xì)胞，觀察各miRNA單獨(dú)或聯(lián)合過表達(dá)對(duì)TGFβ2表達(dá)的影響;將TGFβ2-3'UTR區(qū)上單個(gè)或多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)克隆入pMir-Report報(bào)告基因載體，進(jìn)一步觀察miRNA單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)TGFβ2的直接靶向作用，并評(píng)估m(xù)iR-141、miR-200a和miR-145靶向TGFβ2表達(dá)的協(xié)同作用。⑵qRT-PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各乳腺癌細(xì)胞中TGFβ2的表達(dá)及分泌情況，用TGFβ2重組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)源性

8、低表達(dá)TGFβ2的上皮型乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D、BT474、SKBR3和MDA-MB-453，用TGFβ受體抑制劑SD208和SB525334處理或用pLEX-miRNAs慢病毒顆粒感染內(nèi)源性高表達(dá)TGFβ2的間質(zhì)型乳腺癌細(xì)胞MCF-7/5-Fu、MDA-MB-231和Hs578T，觀察各處理前后細(xì)胞的形態(tài)，MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各細(xì)胞的藥物敏感性、qRT-PCR和westem blot檢測(cè)EMT標(biāo)志物及其他相關(guān)分子、transwell

9、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力、微球體培養(yǎng)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群比例的變化。⑶檢測(cè)TGFβ2重組蛋白誘導(dǎo)MCF-7或TGFβ受體抑制SD208和SB525334處理MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞后miR-141、miR-200a和miR-145的表達(dá)變化;用sh-RNA表達(dá)載體pRNAT-U6.1/sh-snail1轉(zhuǎn)染MCF-7、MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞建立穩(wěn)定Snail1knoc

10、kdown細(xì)胞系，再用TGFβ2或SD208和SB525334處理后檢測(cè)各細(xì)胞中miR-141、miR-200a和miR-145的表達(dá)情況;將miR-141、miR-200a和miR-145前體上游2000bp的DNA片段克隆入pGL4-Luc報(bào)告基因載體，用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-141、miR-200a和miR-145的可能啟動(dòng)子，生物信息分析Snail1與miRNAs啟動(dòng)子的結(jié)合情況并以MDA-MB-231細(xì)胞為模型用C

11、HIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩者的結(jié)合情況;用GSK3β過表達(dá)載體pLV-Ubc-GSK3β轉(zhuǎn)染或DKK1重組蛋白處理MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞后，檢測(cè)miR-141、miR-200a和miR-145的表達(dá)情況。⑷收集耐藥細(xì)胞MCF-7/5-Fu的培養(yǎng)上清液，用收集的上清液培養(yǎng)上皮型乳腺癌細(xì)胞T47D、BT474、SKBR3和MDA-MB-453細(xì)胞，觀察各細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;MTS試驗(yàn)檢測(cè)各細(xì)胞的藥物敏感性;qRT-PCR、Western

12、 blot及免疫熒光檢測(cè)EMT標(biāo)志物的表達(dá);Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞侵襲能力;微球體形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析CD44+CD24-/low干細(xì)胞亞群來檢測(cè)各細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞的比例。⑸通過細(xì)胞因子芯片篩選耐藥細(xì)胞MCF-7/5-Fu和親本MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的差異表達(dá)細(xì)胞因子，用qRT-PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)細(xì)胞因子在各乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，用TNFα、NOV、FGF2和IL-6(稱為cytokines cocktail

13、)單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)MCF-7、T47D、BT474、SKBR3和MDA-MB-453上皮型乳腺癌細(xì)胞，觀察誘導(dǎo)前后各細(xì)胞的形態(tài)，MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)處理前后各細(xì)胞的藥物敏感性、qRT-PCR和Western blot檢測(cè)EMT標(biāo)志物表達(dá)變化、transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞比例的變化，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)合western blot檢測(cè)cytokines cocktail處理后NF-κB、wnt/β-cateni

14、n、Hedgehog、MAPK/ERK和p38 MAPK等多條信號(hào)通路的活化情況，并觀察信號(hào)通路抑制劑NF-κB抑制劑Bay11-7082、Wnt/β-catenin通路抑制劑DKK1、ERK抑制劑PD98059、p38抑制劑SB203580處理對(duì)EMT表型的逆轉(zhuǎn)情況。
　　結(jié)果：①miRNA芯片篩選出35個(gè)差異表達(dá)miRNAs，通過生物信息學(xué)分析MCF-7/5-Fu中低表達(dá)的miR-141、miR-200a和miR-145可能靶

15、向TGFβ2;TGFβ2在MCF-7/5-Fu和間質(zhì)型乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中的mRNA表達(dá)及蛋白分泌明顯高于上皮型乳腺癌細(xì)胞，而相應(yīng)的miR-141、miR-200a和miR-145的表達(dá)明顯較低;含兩個(gè)Copy miRNA前體的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)明顯上調(diào)MCF-7/5-Fu、MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中miR-141、miR-200a和miR-145的表達(dá)，miR-141、miR-200a和miR-

16、145能直接靶向調(diào)控TGFβ2的表達(dá)且miRNAs間呈現(xiàn)協(xié)同作用;在MCF-7細(xì)胞中低劑量TGFβ2能以Snail1依賴性上調(diào)miR-141、miR-200a和miR-145的表達(dá)，而TGFβ受體抑制劑、干擾Snail1表達(dá)、外源性過表達(dá)GSK3β或DKK1處理明顯上調(diào)MDA-MB-231和Hs578T中miR-141/200a和miR-145的表達(dá);Snail1能直接與miR-141、miR-200a和miR-145啟動(dòng)子結(jié)合在轉(zhuǎn)錄水

17、平抑制miRNAs的表達(dá)，而GSK3β能逆轉(zhuǎn)Snail1對(duì)miRNAs的轉(zhuǎn)錄抑制作用。②TGFβ受體抑制劑或miR-141、miR-200a和miR-145過表達(dá)以抑制TGFβ2的表達(dá)僅能部分逆轉(zhuǎn)MCF-7/5-Fu細(xì)胞的EMT表型;而能明顯逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的間質(zhì)表型和耐藥表型，同時(shí)，抑制MDA-MB-231和Hs578T的侵襲能力、干細(xì)胞微球體形成能力和乳腺癌干細(xì)胞比例。在所選的上皮型乳腺癌細(xì)胞中，長(zhǎng)期TGF

18、β2僅能誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞發(fā)生部分EMT變化，有限程度地增加耐藥性、侵襲能力和乳腺癌干細(xì)胞比例。③MCF-7/5-Fu耐藥細(xì)胞的培養(yǎng)上清液能誘導(dǎo)MCF-7、T47D、BT474、SKBR3和MDA-MB-453等上皮型乳腺癌細(xì)胞形成典型EMT表型，細(xì)胞變得狹長(zhǎng)，細(xì)胞之間疏散，呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞樣的表型改變，上皮標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，對(duì)5-Fu的耐藥性增加、細(xì)胞增殖速度加快、侵襲能力增強(qiáng)、微球體形成的數(shù)量增加

19、且體積增大、乳腺癌干細(xì)胞比例增加，暫稱這些誘導(dǎo)而來的細(xì)胞為“二代耐藥細(xì)胞”，以XX/media表達(dá)，如MCF-7/media。④通過細(xì)胞因子芯片篩選，qRT-PCR和ELISA驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TGFβ2、TNFα、NOV、CXCL10、FGF2和IL-6等細(xì)胞因子在MCF-7/5-Fu及除TGFβ2外在XX/media細(xì)胞中的表達(dá)或培養(yǎng)上清中的含量明顯上調(diào)，單一的細(xì)胞因子難以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT，其中CXCL10上調(diào)E-cadheri

20、n的表達(dá)。TNFα、NOV、FGF2和IL-6聯(lián)合應(yīng)用(稱為cytokines cocktail)誘導(dǎo)MCF-7、T47D、BT474、SKBR3和MDA-MB-453細(xì)胞形成明顯的EMT表型(細(xì)胞暫命名:XX/cocktail，如MCF-7/cocktail)，引起EMT相關(guān)分子的變化，增加了細(xì)胞耐藥性、侵襲能力和乳腺癌干細(xì)胞比例。cytokines cocktail能活化細(xì)胞內(nèi)NF-κB、Wnt/β-catenin、Hedgehog

21、、 MAPK/ERK和p38MAPK等多條信號(hào)通路，NF-κB抑制劑Bay11-7082、Wnt/β-catenin通路抑制劑DKK1、ERK抑制劑PD98059、p38抑制劑SB203580聯(lián)合應(yīng)用能明顯逆轉(zhuǎn)MCF-7/cocktail細(xì)胞、MCF-7/5-Fu和MCF-7/media細(xì)胞的EMT表型及EMT標(biāo)志物的表達(dá)。
　　結(jié)論：⑴TGFβ2/Snail1/miRNAs形成的負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路維持間質(zhì)型乳腺癌細(xì)胞TGFβ2的高表

22、達(dá)和miR-141、miR-200a和miR-145的低表達(dá)狀態(tài)。⑵GSK3β或DKK1能逆轉(zhuǎn)Snail1對(duì)miR-141、miR-200a和miR-145的轉(zhuǎn)錄抑制作用。⑶TGFβ2在維持乳腺癌細(xì)胞EMT表型具有細(xì)胞依賴性，抑制TGFβ信號(hào)能明顯逆轉(zhuǎn)對(duì)TGFβ2有依賴性的先天性間質(zhì)型乳腺癌細(xì)胞的間質(zhì)表型，而僅能部分逆轉(zhuǎn)化療誘導(dǎo)的獲得性耐藥乳腺癌細(xì)胞的EMT表型。⑷MCF-7/5-Fu細(xì)胞的培養(yǎng)上清液能誘導(dǎo)上皮型乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，首

23、次發(fā)現(xiàn)已獲得耐藥表型乳腺癌細(xì)胞對(duì)原發(fā)乳腺癌細(xì)胞的影響。⑸細(xì)胞因子TNFα、NOV、FGF2和IL-6可能在維持乳腺癌獲得性耐藥細(xì)胞的EMT表型中起著關(guān)鍵作用，cytokines cocktail能誘導(dǎo)不同遺傳背景的上皮型乳腺癌細(xì)胞發(fā)生明顯的EMT表型，NF-κB、Wnt/β-catenin、Hedgehog、 MAPK/ERK和p38 MAPK等信號(hào)通路介導(dǎo)了cytokines cocktail對(duì)乳腺癌細(xì)胞的EMT誘導(dǎo)作用，提示化療誘導(dǎo)