結(jié)核分枝桿菌Rv2032和Rv3127的克隆、表達(dá)與功能鑒定.pdf

1、該論文的目的是(1)從結(jié)核分枝桿菌中分別克隆Rv2032和Rv3127基因;(2)構(gòu)建以大腸桿菌為宿主的表達(dá)質(zhì)粒pET16b-Rv2032和pET16b-Rv3127和以分枝桿菌為宿主的表達(dá)質(zhì)粒pVV2-Rv2032和pVV2-Rv3127;(3)分別在大腸桿菌BL21(DE30和恥垢分枝桿菌M.semgmatics Mc<'2>155菌株中表達(dá)目標(biāo)蛋白以篩選高表達(dá)工程菌株;(4)鑒定Rv2032和Rv3127蛋白質(zhì)的功能.該論文所獲得

2、的結(jié)果如下:1.擴(kuò)增Rv2032和Rv3127基因從結(jié)核分枝桿菌H37R v菌株基因組數(shù)據(jù)庫(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/)中獲得Rv2032和Rv3127基因的核苷酸序列.根據(jù)核苷酸序列設(shè)計PCR引物,并在每一基因的上、下游引物中分別引入了NdeI和BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn).利用LA Taq DNA聚合酶成功地從H37Rv菌株基因組DNA中擴(kuò)增了Rv2032和Rv3127基因,在Rv

3、2032和Rv3127基因的PCR產(chǎn)物的兩端分別攜帶NdeI和BamHI位點(diǎn).2.克隆Rv2032和Rv3127基因和測定DNA序列將上述PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18-T的EcoRV位點(diǎn),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株的感受態(tài)細(xì)胞中.用限制性內(nèi)切酶酶切方法篩選出陽性重組質(zhì)粒pMD18-Rv2032(＃3)和pMD18-Rv3127(＃3).對Rv2032和Rv3127基因進(jìn)行DNA序列測定,測序結(jié)果與結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌

4、株基因組數(shù)據(jù)庫中的Rv2032和Rv3127基因序列完全一致,表明用PCR技術(shù)擴(kuò)增的Rv2032和Rv3127基因不存在任何堿基突變.3.構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒用NdeI和BamHI雙酶切陽性重組克隆質(zhì)粒pMD18-Rv2032(＃3)和pMD18-Rv3127(＃3),純化Rv2032和Rv3127基因,將Rv2032和Rv3127基因分別連接到用于大腸桿菌的表達(dá)載體pET16b及用于分枝桿菌的表達(dá)載體pVV2的NedI和BamHI 位點(diǎn).將連

5、接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaBlue菌株的感受態(tài)細(xì)胞中,用限制性內(nèi)切酶酶切方法和PCR方法篩選出陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pET16b-Rv2032(＃1)和pET16b-Rv3127(＃1)以及pVV2-Rv2032(＃2)和pVV2-Rv3127(＃2).每一重組表達(dá)質(zhì)粒中的目的基因產(chǎn)物的N端與表達(dá)質(zhì)粒上的多聚組氨酸(His<,10>標(biāo)記形成融合蛋白,便于目的蛋白的檢測和純化.4.Rv2032和Rv3127目的蛋白的表達(dá)1)目的蛋白在大腸桿菌