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1、南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文肝細(xì)胞癌MAGEA9基因的克隆、表達(dá)及特性鑒定姓名:徐璐申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專業(yè):病理學(xué)指導(dǎo)教師:馮振卿20050420南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文MAGE—A9基因,經(jīng)T—A連接克隆_@pMDl8一T載體,測(cè)序,并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的MAGEA9cDNA序列比對(duì)。2限制性酶切圖譜鑒定pMDl8一T—MAGEA9克隆載體。采用質(zhì)粒抽提、純化、酶切、連接、感受態(tài)細(xì)菌制備和轉(zhuǎn)化等技術(shù),構(gòu)建并鑒定原核表達(dá)載體。藥物誘
2、導(dǎo)MAGEA9蛋白表達(dá),SDS—PAGE7tWesternblot初步鑒定表達(dá)結(jié)果,然后將細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)物超聲裂解,再用HiTrap親和柱純化超聲裂解上清。3MAGEA9蛋白純化產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤SP2/O細(xì)胞與免疫小鼠的脾細(xì)胞按常規(guī)PEG方法融合,有限稀釋法克隆細(xì)胞。ELISA法檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清與MAGEA9蛋白的效價(jià),Dotblot檢驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清與MAGE—A9的結(jié)合活性。4免疫組4tABC法檢壩JM
3、AGEA9基因在Hcc組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位。研究結(jié)果1擴(kuò)增出約945bp的MAGE—A9基因,測(cè)序證實(shí)其序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道序列完全一致。2限制酶切結(jié)果顯示克隆載體pMDl8T—MAGEA9構(gòu)建成功。原核分泌型表達(dá)系統(tǒng)pBAD/gIII州AGE—A9在大腸桿菌Topl0中被誘導(dǎo)表達(dá),獲得有多聚組氨酸(His)。標(biāo)簽序列的重組表達(dá)蛋白,冷凍超聲裂菌法分離結(jié)果顯示MAGE—A9表達(dá)蛋白在菌體大部分為可溶性表達(dá)。用HiTrap柱純
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