N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶AidE的初步晶體學(xué)研究.pdf

1、在一些革蘭氏陰性病原菌如綠膿假單胞菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌中，毒力因子產(chǎn)生、生物膜形成、生物發(fā)光、抗生素合成、粘附、群游現(xiàn)象、孢子形成等行為與群體感應(yīng)系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系。群體感應(yīng)參與微生物分泌特定分子如自體誘導(dǎo)劑來調(diào)節(jié)種內(nèi)和種間密度。介導(dǎo)細(xì)胞間通路的小分子的結(jié)構(gòu)是多樣的，其中一大類信號(hào)分子由Ⅳ-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)組成。群體感應(yīng)系統(tǒng)以可擴(kuò)散的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞分子，AHL的濃度在調(diào)節(jié)病原細(xì)菌的毒力基因表達(dá)和相關(guān)

2、重要生物功能上發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一些生物含有編碼AHL內(nèi)酯酶的基因，編碼的內(nèi)酯酶可破壞AHLs的內(nèi)酯環(huán)，從而阻斷群體感應(yīng)系統(tǒng)。
　　AidE是一種來源于蒼白桿菌屬的AHL內(nèi)酯酶，目前沒有關(guān)于AidE結(jié)構(gòu)與功能方面的報(bào)道。本研究運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建AidE重組蛋白，過表達(dá)、運(yùn)用Ni親和層析、凝膠過濾層析和離子交換層析進(jìn)行蛋白樣品的純化和制各，獲得電荷均一、分子量大小以及聚體形式均一的AidE蛋白。進(jìn)一步通過優(yōu)化Ni親和層析、凝膠過濾

3、層析和離子交換層析的純化步驟，獲得兩相均一的硒代AidE蛋白。AidE是一種對(duì)AHL酰胺鏈長度和C3位取代基具有底物寬泛性的鋅離子依賴型AHL內(nèi)酯酶。一級(jí)序列比對(duì)分析表明，AidE與其它已知的AHL內(nèi)酯酶的同源度小于25％。根據(jù)該系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，AidE屬于金屬-β-內(nèi)酰胺酶家族，為金屬依賴蛋白，含有金屬結(jié)合基序“HXHXDH”。運(yùn)用坐滴法和懸滴法對(duì)AidE蛋白進(jìn)行晶體生長條件的篩選，獲得最初微晶生長條件，最終在1.575 M a

4、mmoniumsulfate，0.1 M sodium cacodylate trihydrate pH6.6，0.01 M cobalt(Ⅱ) chloride條件下獲得了AidE的單晶，并收集衍射數(shù)據(jù)。運(yùn)用衍射數(shù)據(jù)處理軟件HKL2000處理得到AidE初步晶體學(xué)數(shù)據(jù)。AidE蛋白晶體屬于正交晶系，空間群為P2221。在其結(jié)構(gòu)解析的過程中，由于AidE晶胞的一個(gè)不對(duì)稱單位里存在10個(gè)分子，因此不能用分子置換法進(jìn)行求解，而必須用實(shí)驗(yàn)相角