細(xì)粒棘球絳蟲重組抗原Eg10應(yīng)用價(jià)值的評(píng)價(jià).pdf

1、目的：以細(xì)粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲重組抗原Eg10應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與天然抗原（HCF、原頭蚴）進(jìn)行比對(duì)。 方法：⑴動(dòng)物模型的建立：Balb/c小鼠35只，20只腹腔接種2000psc/只，10只心腔接種400psc/只，余者注射高壓滅菌1×PBS作為對(duì)照，建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠動(dòng)物模型。⑵重組蛋白Eg10的制備：以人源細(xì)粒棘球蚴原頭蚴總RNA為模板，據(jù)Genbank檢索的Eg10基因片段序列設(shè)計(jì)一對(duì)引

2、物，通過RT-PCR擴(kuò)增目的基因片段；將目的基因克隆到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，對(duì)重組基因進(jìn)行測(cè)序；結(jié)果正確無誤后，再將目的基因亞克隆至pET28a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS，構(gòu)建細(xì)粒棘球蚴Eg10基因原核表達(dá)體系，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，反復(fù)凍融以確定表達(dá)產(chǎn)物的溶解性并利用Novagen His·Bind 純化試劑盒純化此蛋白并以此純化蛋白免疫ICR小鼠，通過ELISA檢測(cè)其免疫原性。⑶動(dòng)物模型對(duì)Eg

3、10和天然抗原的評(píng)價(jià)：以Eg10和HCF作為抗原，通過ELISA檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠血清特異性IgG、IgG1、IgG2a及IgG3抗體水平的動(dòng)態(tài)變化；通過WB檢測(cè)此血清能否識(shí)別Eg10及天然抗原中相應(yīng)的條帶。 結(jié)果：⑴接種6個(gè)月后處死所有小鼠，剖腹、剖胸檢查包囊生長(zhǎng)情況，30只實(shí)驗(yàn)鼠中有包囊長(zhǎng)出者為19只(含中期死亡2只)，腹腔接種較心腔接種感染率高（85％：20％），雌鼠較雄鼠感染率高 (72％：50％)，但經(jīng)確切概率法

4、檢驗(yàn)無論是腹腔接種與心腔接種還是雌鼠與雄鼠之間均沒有顯著性差異。所長(zhǎng)包囊經(jīng)病理組織切片檢查證實(shí)為包蟲囊泡。⑵ Eg10/pET28a/BL21(DE3)plysS能夠誘導(dǎo)表達(dá)出一與Eg10基因理論推測(cè)蛋白分子量一致的31kDa 條帶，表達(dá)量約占菌體總蛋白的52％，反復(fù)凍融后確定此蛋白以不溶性的包涵體形式表達(dá)；小鼠免疫2w后，IgG抗體值開始增高，第6w達(dá)最高值，8w后開始下降。⑶細(xì)粒棘球蚴感染小鼠血清ELISA及WB結(jié)果提示：以HCF作

5、為包被抗原，特異性IgG抗體及其亞類都有不同程度的增高，在IgG亞類中以IgG1增高為主；以Eg10作為包被抗原，特異性IgG抗體自感染棘球蚴后持續(xù)增高，而其亞類IgG1、IgG2a、IgG3未見明顯增加，間接反應(yīng)IgG2b為主要增高的IgG亞類；此血清能識(shí)別重組蛋白Eg10及原頭蚴中相應(yīng)條帶。 結(jié)論：成功的制備了細(xì)粒棘球蚴繼發(fā)性感染Balb/c小鼠模型，經(jīng)腹腔接種原頭蚴動(dòng)物死亡率低、包囊形成快；成功的克隆了Eg10基因并構(gòu)建