降糖藥艾塞那肽和利拉魯肽的固相合成及艾塞那肽的藥效學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、目的:
　　 本題旨在合成多肽類降糖藥艾塞那肽和利拉魯肽，確定一條操作簡單可行的固相合成路線;摸索制備型高效液相純化兩種藥物的條件并得到純度為99％以上的多肽;部分藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明艾塞那肽的刺激胰島β細(xì)胞增殖作用和降糖作用。
　　 方法:
　　 1.合成部分:艾塞那肽和利拉魯肽合成路線均采用固相合成法，9-芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，分別利用Rink酰氨MBHA樹脂(負(fù)載量0.23mmol/L)和Fmoc-Gl

2、y-Wang樹脂(負(fù)載量為0.27mmol/L)作為載體、6-氯-1-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基碳二亞胺為縮合劑，三氟乙酸為切割試劑。中間過程采用茚三酮檢測鑒定是否反應(yīng)完全。采用半制備型高效液相進(jìn)行純化，色譜柱為安捷倫ZORBAXSB-C18型半制備色譜柱(9.4*250mm)，流速4mL/min;波長220nm;進(jìn)樣量每次1mL;流動(dòng)相A:水(含0.1％TFA);流動(dòng)相B:乙腈(含0.1％TFA)，摸索純化條件收集產(chǎn)物峰冷凍干燥

3、。高效液相法測定其含量，質(zhì)譜鑒定產(chǎn)物分子量。
　　 2.艾塞那肽的部分藥效學(xué)實(shí)驗(yàn):采用MTT法檢測其對(duì)大鼠胰島(INS-1)細(xì)胞的增殖活性作用，分別在不同濃度的本實(shí)驗(yàn)室制備得艾塞那肽和對(duì)照品(禮來公司的艾塞那肽注射液)干預(yù)下培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，測定吸光度值看是否刺激細(xì)胞增殖，計(jì)算增殖率及ED50以對(duì)比兩種藥物活性是否相當(dāng)。腹腔注射鏈佐霉素誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，成模后分為四組:(1)空白組;(2)糖尿病模型組;(3)禮來公司艾塞那肽

4、注射液組;(4)本實(shí)驗(yàn)室制備艾塞那肽組。用藥15d期間間隔測量血糖觀察其降血糖作用。停藥1周后，禁食不禁水16小時(shí)進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.合成部分:得到明確的合成路線及純化條件，艾塞那肽洗脫梯度為:初始梯度A占90％，A的比例在15min內(nèi)降到67％，然后在50min內(nèi)由67％降到58％，最后在5min內(nèi)降到0％并保持10min。產(chǎn)物峰在25min左右出現(xiàn)。利拉魯肽洗脫梯度為:初始梯度A占85％，A

5、的比例在5min內(nèi)降到70％，然后在25min內(nèi)由70％降到50％，保持50％10min，最后在10min內(nèi)降到0％并保持10min。利拉魯肽的產(chǎn)物峰在33min左右出現(xiàn)。收集到的產(chǎn)物峰冷凍干燥最終得艾塞那肽純品51.5mg，收率為12.3％，歸一化法計(jì)算純度為99.73％。利拉魯肽制得純品39.4mg，收率為10.5％。歸一化法計(jì)算純度為93.5％。經(jīng)質(zhì)譜鑒定艾塞那肽分子量為4186，利拉魯肽為3751，與實(shí)際分子量相符。
　　

6、 2.艾塞那肽的部分藥效學(xué)實(shí)驗(yàn):艾塞那肽可以刺激胰島細(xì)胞的增殖活性，在濃度為120nmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng);本實(shí)驗(yàn)室合成的艾塞那肽與對(duì)照品艾塞那肽注射液活性相當(dāng);連續(xù)注射艾塞那肽后，樣品組與對(duì)照組小鼠血糖明顯低于糖尿病模型組(P＜0.05)，樣品組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)意義;糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明艾塞那肽能明顯改善糖尿病小鼠的糖耐量曲線。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩條路線操作簡單、試劑單一、成本較低，可以