艾塞那肽對間歇性高糖影響β細胞增殖周期的干預機制研究.pdf

1、背景:當今,全球糖尿病正處于快速增長期,我國糖尿病患病率也逐年增高,現(xiàn)已成為僅次于印度的糖尿病第二大國。2型糖尿病發(fā)病隱匿,患者病程長,隨著病程的進展,胰島β細胞功能漸進衰竭。因此,探索糖尿病的發(fā)病機制一直是糖尿病領域研究的熱點及重點。糖尿病患者體內(nèi)的血糖穩(wěn)態(tài)遭到破壞,不僅存在血糖升高,且包含著另一個重要的方面即血糖波動。正常人的血糖受到精密的調(diào)控,被限定在一個很小的范圍內(nèi),而糖尿病患者的血糖波動明顯增加。波動性高血糖對糖尿病并發(fā)癥的影

2、響已有較多的研究,業(yè)已證實其能增強蛋白激酶C(PKC)的活性,激活氧化應激反應,同時還可以促進內(nèi)皮細胞的凋亡。但是關于波動性高糖對胰島β細胞量及β細胞增殖的影響目前鮮見研究報道。
　　 隨著研究的深入,人們逐漸認識到胰島β細胞“質(zhì)”和“量”的動態(tài)變化對于血糖的調(diào)控以及糖尿病的臨床進程都具有舉足輕重的影響。β細胞其數(shù)目的變化與其他細胞一樣,受到細胞周期進程的調(diào)控。β細胞的細胞周期按照各時相(G1-S—G2-M)嚴格有序進行。細胞周

3、期又受到細胞周期相關系列蛋白的嚴密調(diào)控,其中一些蛋白促進細胞周期進程,起到正性調(diào)控的作用,另一方面,一些蛋白阻滯細胞周期進程,對細胞周期進程進行負性調(diào)控。很多因素可能通過影響某些細胞周期蛋白,進而使細胞周期的調(diào)控障礙而影響細胞增殖,如:高糖、高脂等。細胞周期相關蛋白細胞周期素D1(cyclinD1)是一種促進細胞周期進程的蛋白,它在細胞周期進程中與其相應的細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclindependent kinase CDK)結合

4、在一起,驅動細胞周期進程,cyclinD1在β細胞中表達,調(diào)節(jié)β細胞的增殖。p21與p27是兩個抑制細胞周期進程的蛋白,他們均可與cyclin-CDKs結合,使該復合物的激酶活性喪失,阻滯細胞周期,對細胞周期起到負性調(diào)控的作用。S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase associatedprotein-2 Skp2)可通過泛素化降解p27,從而促進細胞周期進程。這幾個細胞周期相關蛋白對細胞增殖的影響可能在整個細胞周期進程中起到

5、重要的作用。
　　 近年來探尋促進β細胞的增殖及減少凋亡的研究備受關注。胰高糖素樣肽-1是由小腸內(nèi)分泌L細胞分泌的腸道促胰島激素,可促進胰島β細胞增殖,減少凋亡,增加胰島β細胞數(shù)量。這使得GLP-1越來越受到研究者們的重視,然而GLP-1是否可以通過改變某些細胞周期相關蛋白而影響β細胞的周期變化,進而影響到細胞的增殖活性,目前仍不明了。
　　 因此,本課題以β細胞株INS-1細胞為研究對象,從以下幾個方面進行相關研究:1

6、,觀察間歇性高糖對INS-1細胞凋亡的影響并探討其可能的作用機制。2,了解INS-1細胞增殖水平發(fā)生變化時的細胞周期分布的改變,通過檢測間歇性高糖對細胞周期相關蛋白cyclinD1、p21、p27及Skp2蛋白表達水平的影響,探討間歇性高糖時INS-1細胞增殖及細胞周期進程與細胞周期相關蛋白變化的關系。3,觀察GLP-1受體激動劑Exenatide對間歇性高糖影響INS-1細胞的作用,檢測應用Exenatide后細胞增殖、凋亡水平、細胞

7、周期的分布,及細胞周期相關蛋白cyclinD1、p21、p27及Skp2蛋白表達水平,探討Exenatide對間歇性高糖影響INS-1細胞是否具有保護作用。
　　 第一部分、間歇性高糖對INS-1細胞凋亡的影響及其機制探討
　　 目的:探討間歇性高糖對INS-1細胞凋亡的影響及可能的作用機制。
　　 方法:
　　 (1)INS—1細胞的培養(yǎng)及活性鑒定:以含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基在37

8、℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。0.4％臺盼藍染色檢測細胞活性。
　　 (2)間歇性高糖對INS-1細胞凋亡的影響:用6孔板鋪板細胞,用無酚紅、無血清RPMI-1640預處理,37℃、5％CO2中培養(yǎng)6h,使其處于同步化狀態(tài)。每24 h換液。實驗分為3組:正常葡萄糖濃度組(簡稱正常糖組),即細胞培養(yǎng)于5.5mmol/L葡萄糖濃度的RPMI-1640完全培養(yǎng)基；恒定性高濃度葡萄糖組(簡稱恒定性高糖組),細胞培養(yǎng)于30 mmol/L

9、葡萄糖濃度的RPMI-1640完全培養(yǎng)基；間歇性高濃度葡萄糖組(簡稱間歇性高糖組),即每24 h輪換培養(yǎng)于5.5mmol/L或30mmol/L葡萄糖濃度的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。各組細胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)7天,Annexin V-FITC/PI流式檢測細胞凋亡率。
　　 (3)間歇性高糖對INS-1細胞活性氧(ROS)水平及黃嘌呤氧化酶(XOD)水平的影響:分組及培養(yǎng)條件同上,熒光探針DCFH—DA法檢測細胞活

10、性氧(ROS)水平,酶標分光光度法檢測細胞黃嘌呤氧化酶(XOD)含量。
　　 結果:
　　 (1)INS-1細胞形態(tài)觀察及活性測定:INS-1細胞多數(shù)為不規(guī)則但折光性強,細胞有連接融合傾向,胞漿內(nèi)可見顆粒。臺盼藍染色細胞活性為(94.00±1.35)％。
　　 (2)間歇性高糖對INS-1細胞凋亡影響:在正常糖組,INS-1凋亡較少(8.91±2.92)％,恒定性高糖組INS-1凋亡率增加(20.92±3.88)

11、％,間歇性高糖組INS-1細胞凋亡增多更加明顯(30.67±4.48)％。三組間差異有統(tǒng)計學意義(F=40.842,P=0.000),恒定性高糖組和間歇高糖組的凋亡率與正常糖組相比較都具有統(tǒng)計學差異(P=0.000,P=0.000)；間歇性高糖組的凋亡率高于恒定性高糖組(P=0.002)。
　　 (3)間歇性高糖對INS-1細胞活性氧(ROS)水平的影響:正常糖組的INS-1細胞內(nèi)ROS的含量處于較低水平(DCFH平均熒光強度為

12、:156.00±13.27,恒定性高糖組(311.00±22.77)和間歇性高糖組(409.60±12.44)INS-1細胞內(nèi)ROS的含量均增多,三組間ROS差異有統(tǒng)計學意義(F=288.649,P=0.000),恒定性高糖組和間歇性高糖組ROS水平均高于正常糖組(P=0.000。P=0.000),且恒定性高糖組與間歇性高糖組的ROS水平比較也具有統(tǒng)計學差異(P=0.000)。
　　 (4)間歇性高糖對INS-1細胞黃嘌呤氧化酶

13、(XOD)含量的影響:正常糖組INS—1細胞內(nèi)XOD的含量處于較低水平(XOD的OD值:0.23±0.03),恒定高糖組(0.58±0.03)和間歇性高糖組(0.79±0.03)INS-1細胞內(nèi)XOD的含量都明顯增多,三組間XOD差異有統(tǒng)計學意義(F=84.7.885,P=0.000),恒定性高糖組和間歇性高糖組與正常糖組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.000,P=0.000),且恒定性高糖組INS-1細胞XOD含量明顯低于間歇性高

14、糖組(P=0.000)。
　　 結論:正常糖組INS-1細胞的凋亡率明顯低于恒定性高糖組及間歇性高糖組,其中間歇性高糖組的凋亡率最高。其相應的細胞內(nèi)ROS及XOD含量為:正常糖組<恒定性高糖組<間歇性高糖組,提示氧化應激可能與INS-1細胞凋亡率增高有關。
　　 第二部分、間歇性高糖對INS-1細胞增殖和細胞周期進程的影響及其分子機制探討
　　 目的:探討間歇性高糖對INS-1細胞周期調(diào)控蛋白水平的影響,進而了解

15、影響INS-1細胞增殖的細胞周期進程的可能分子機制。
　　 方法:
　　 (1)間歇性高糖對INS-1細胞周期進程的影響:用6孔板鋪板細胞,用無酚紅、無血清RPMI-1640預處理,即37℃、5％CO2中培養(yǎng)6h,使其處于同步化狀態(tài)。每24 h換液。實驗分為3組:正常糖組,即培養(yǎng)于5.5mmol/L葡萄糖濃度的RPMI-1640完全培養(yǎng)基；恒定性高糖組,培養(yǎng)于30mmol/L葡萄糖濃度的RPMI-1640完全培養(yǎng)基；間歇

16、性高糖組,即每24 h輪換培養(yǎng)于5.5mmol/L或30mmol/L葡萄糖濃度的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。各組細胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)7天,碘化丙啶染色及流式細胞儀檢測細胞周期。
　　 (2)間歇性高糖對INS-1細胞cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白表達的影響:分組及培養(yǎng)條件同上,用免疫熒光細胞染色各組INS-1細胞,倒置熒光顯微鏡下觀察INS—1細胞中cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白的

17、表達,用Western-blot檢測cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白表達水平,計算蛋白相對灰度值。
　　 (3)間歇性高糖對INS-1細胞增殖活性的影響:分組及培養(yǎng)條件同上,CellCounting Kit-8試劑盒檢測細胞增殖活性。
　　 結果:
　　 (1)間歇性高糖對INS-1細胞周期進程的影響:與正常糖組G0/G1期細胞比值(48.75±3.11)％相比較,恒定性高糖組(56.54±3.50

18、)％及間歇性高糖組(65.53±3.63)％的比值明顯增高,三組間G0/G1期細胞比值差異有統(tǒng)計學意義(F=30.214,P=0.000)。恒定性高糖組和間歇性高糖組G0/G1期細胞比值均高于正常糖組(P=0.004。P=0.000),間歇性高糖組也高于恒定性高糖組(P=0.001)。
　　 (2)間歇性高糖對INS-1細胞cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白表達的影響:
　　 Western blot方法檢測

19、的三組間cyclinD1蛋白表達水平有顯著差異(F值=97.125,P=0.000)。恒定性高糖組(0.31±0.02)及間歇性高糖組cyclinD1表達水平(0.18±0.03)明顯低于正常糖組(0.46±0.03),P均=0.000,且間歇性高糖組cyclinD1蛋白表達也低于恒定性高糖組(P=0.001)。
　　 Western blot方法檢測三組間Skp2蛋白表達水平有顯著差異(F=45.972,P=0.000)。恒定

20、性高糖組(0.31±0.03)及間歇性高糖組Skp2表達水平(0.21±0.03)明顯低于正常糖組(0.48±0.05),P均=0.000,且間歇性高糖組Skp2蛋白表達也低于恒定性高糖組(P=0.011)。
　　 Western blot方法檢測三組問p27蛋白表達水平有顯著差異(F=79.360,P=0.000)。恒定性高糖組p27表達水平(0.38±0.04)及間歇性高糖組(0.51±0.03)明顯高于正常糖組(0.20±

21、0.03),P均=0.000,且間歇性高糖組p27蛋白表達水平也高于恒定性高糖組(P=0.002)。
　　 Western blot方法檢測三組間p21蛋白表達水平有顯著差異(F=50.220,P=0.000)。恒定性高糖組p21表達水平(0.40±0.03)及間歇性高糖組(0.51+0.04)高于正常糖組(0.19±0.05),與正常糖組比較,恒定性高糖組P=0.001,間歇性高糖組P=0.000,且間歇性高糖組p21蛋白表達

22、水平也高于恒定性高糖組(P=0.011)。
　　 (3)間歇性高糖對INS-1細胞增殖活性的影響:正常糖組細胞增殖活性較高(OD值:1.51±0.14)。恒定性高糖組(0.67±0.04)與間歇性高糖組(0.45±0.02)的增殖活性都較正常糖組明顯降低,三組間差異有統(tǒng)計學意義(F=2778,P=0.000),恒定性高糖組和間歇性高糖組與正常糖組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.000,P=0.000),且間歇性高糖組明顯低于

23、恒定性高糖組(P=0.000)。
　　 結論:本部分研究結果顯示:體外不同血糖濃度變化影響INS-1細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白p21,p27,其表達水平為正常糖組<恒定性高糖組<間歇性高糖組；而細胞周期正性調(diào)控蛋白cyclinD1,Skp2蛋白的表達水平則是正常糖組>恒定性高糖組>間歇性高糖組,與此相應的是細胞周期進程中G0/G1期細胞比值依次增高,細胞的增殖活性依次減低。這些結果表明:間歇性高糖可通過改變INS-1細胞周期

24、調(diào)控蛋白水平,進一步阻滯INS-1細胞周期進程,從而減弱細胞的增殖活性。
　　 第三部分、艾塞那肽對間歇性高糖影響INS-1細胞增殖及細胞周期進程干預的分子機制
　　 目的:通過探討艾塞那肽對間歇性高糖影響INS—1細胞增殖及細胞周期進程的相關蛋白的作用,了解其干預細胞增殖變化的有關分子機制。
　　 方法:
　　 (1)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS-1細胞凋亡的影響:實驗分為5組:1,正常糖組,即培養(yǎng)

25、于5.5mmol/L葡萄糖濃度的RPMI-1640完全培養(yǎng)基；2,恒定性高糖組,培養(yǎng)于30 mmol/L葡萄糖濃度的RPMI-1640完全培養(yǎng)基；3,間歇性高糖組,即每24 h輪換培養(yǎng)于5.5mmol/L或30mmol/L葡萄糖濃度的RPMI-1640完全培養(yǎng)基；4,恒定性高糖+Exenatide組,培養(yǎng)基含30mmol/L葡糖糖并加入終濃度為100 nmol/L Exenatide；5,間歇性高糖+Exenatide組,間歇性高糖的基

26、礎上加入終濃度為100nmol/L Exenatide。各組細胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)7天,Annexin V-FITC/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　 (2)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS-1細胞活性氧(ROS)水平的影響:分組及培養(yǎng)條件同上,熒光探針DCFH-DA法檢測細胞活性氧(ROS)水平。
　　 (3)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS-1細胞黃嘌呤氧化酶(XOD)含量的影響:分組及培養(yǎng)條件同上,

27、酶標分光光度法檢測細胞黃嘌呤氧化酶(XOD)含量。
　　 (4)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS-1細胞增殖活性的影響:分組及培養(yǎng)條件同上,Cell Counting Kit-8試劑盒檢測細胞增殖活性。
　　 (5)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS-1細胞周期進程的影響:分組及培養(yǎng)條件同上,碘化丙啶染色及流式細胞儀檢測細胞周期。
　　 (6)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS—1細胞cyclinD1、p21、p27

28、、Skp2蛋白表達的影響:分組及培養(yǎng)條件同上,Western—blot檢測cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白的表達,并用免疫熒光細胞化學方法染色各組細胞,觀察蛋白表達情況。
　　 結果:
　　 (1)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS-1細胞凋亡的影響:
　　 各組細胞凋亡結果顯示,五組間差異具有統(tǒng)計學意義(F=44.996,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide組的凋亡率(8.81±1.96

29、)％明顯低于恒定性高糖組(20.92±3.88)％,P=0.000,而與正常糖組(8.91±2.92)％比較,差異則無統(tǒng)計學意義(P=0.962)。間歇性高糖+Exenatide組的凋亡率為(9.18±2.52)％,明顯低于間歇性高糖組(30.67±4.48)％,(P=0.000),與正常糖組(8.91±2.92)％比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.889)。
　　 (2)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS-1細胞活性氧(ROS)水

30、平的影響:
　　 各組細胞內(nèi)ROS含量:五組間INS-1細胞ROS水平有顯著性差異(F=182.781,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide組ROS水平(平均熒光強度為:202.20±14.55)明顯低于恒定性高糖組(311.00±22.77),P=0.000,但仍然高于正常糖組(156.00±13.27,P=0.000)。間歇性高糖+Exenatide組ROS水平(196.00±20.32)明顯低于間歇性高糖組(4

31、09.60±12.44),P=0.000,但仍然高于正常糖組(P=0.001)。
　　 (3)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS-1細胞黃嘌呤氧化酶(XOO)含量的影響:
　　 五組間差異具有統(tǒng)計學意義(F=115.038,P,0.000),恒定性高糖+Exenatide組XOD含量(0.26±0.16)明顯低于恒定性高糖組(0.58±0.03),P=0.000。但與正常糖組(0.23±0.03)比較差異則無統(tǒng)計學意義(P

32、=0.314)。間歇性高糖+Exenatide組XOD含量(0.23±0.02)明顯低于間歇性高糖組(0.79±0.33),P=0.000,而與正常糖組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.858)。
　　 (4)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS—1細胞增殖活性的影響:
　　 玉組間差異有統(tǒng)計學意義(F=3026,P=0.000),恒定性高糖+Exenatide組細胞增殖活性(1.54±0.13)明顯高于恒定性高糖組(0.67

33、±0.04),P=0.000,且高于正常糖組(1.51±0.14,P=0.018)。間歇性高糖+Exenatide組細胞增殖活性(1.45±0.12)明顯高于間歇性高糖組(0.45±0.02),P=0.000,但低于正常糖組(P=0.000)。
　　 (5)艾塞那肽對間歇性高糖作用下INS-1細胞周期進程的影響:
　　 研究結果顯示:G0/G1期細胞比值五組間差異具有統(tǒng)計學意義,(F=20.054,P=0.000)。恒定

34、性高糖+Exenatide組G0/G1期細胞比值(49.12±3.72)％明顯低于恒定性高糖組(56.54±3.50)％,P=0.004,但與正常糖組(48.75±3.11)％比較,沒有統(tǒng)計學差異(P=0.872)。間歇性高糖+Exenatide組G0/G1期細胞比值(49.73±4.04)％明顯低于間歇性高糖組(65.54±3.63)％,P=0.000,但與正常糖組比較,沒有統(tǒng)計學差異(P=0.672)。
　　 (6)艾塞那肽

35、對間歇性高糖作用下INS-1細胞cyclinD1、p21、p27、Skp2蛋白表達的影響:
　　 五組INS-1細胞cyclinD1蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=29.284,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide組cyclinD1表達水平(0.41±0.02)明顯高于恒定性高糖組(0.31±0.02),P=0.006。但與正常糖組(0.46±0.03)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.131)。間歇性高糖+Exenat

36、ide組cyclinD1表達水平(0.43±0.07)明顯高于間歇性高糖組(0.18±0.03),P=0.000,但與正常糖組比較,則差異無統(tǒng)計學意義(P=0.347)。
　　 五組INS—1細胞Skp2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=65.300,P=0.000),恒定性高糖+Exenatide組Skp2表達水平(0.65±0.05)明顯高于恒定性高糖組(0.31±0.03,P=0.000),且高于正常糖組(0.48±0.05,

37、P=0.001)。間歇性高糖+Exenatide組Skp2表達水平(0.66±0.05)明顯高于間歇性高糖組(0.21±0.03,P=0.000),且高于正常糖組(0.48±0.05,P=0.001)。
　　 五組間p27蛋白表達水平有顯著差異(F=54.514,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide組p27表達水平(0.24±0.03)明顯低于恒定性高糖組(0.38±0.04),P=0.000。但與正常糖組(0.20

38、±0.03)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.114)。間歇性高糖+Exenatide組p27表達水平(0.23±0.02)明顯低于間歇性高糖組(0.51±0.03),P=0.000,但與正常糖組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.092)。
　　 五組間p21蛋白表達水平有顯著差異(F=40.296,P=0.000)。恒定性高糖+Exenatide組p21表達水平(0.21±0.05)明顯低于恒定性高糖組(0.40±0.03),P=0

39、.000。但與正常糖組(0.19±0.05)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.540)。間歇性高糖+Exenatide組p21表達水平(0.22±0.03)明顯低于間歇性高糖組(0.51±0.04),P=0.000,但與正常糖組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.417)。
　　 結論:艾塞那肽的干預可減少間歇性及恒定性高糖下INS—1細胞內(nèi)ROS及XOD水平,進而減少INS-1細胞的凋亡,同時在間歇性或恒定性高糖條件下,艾塞那肽使I