FK506抑制神經(jīng)鈣調蛋白改善顳葉癲癇病程和記憶學習能力的實驗研究.pdf

1、本研究為CaN抑制劑在臨床的應用提供了可靠地理論依據(jù)。
　　 本研究分為三部分：
　　 第一部分：立體定向側腦室海人酸注射誘導顳葉癲癇大鼠模型的建立及腦電、病理學觀察
　　 目的：
　　 立體定向海人酸側腦室注射誘導顳葉癲癇大鼠模型，觀察致癇過程中大鼠行為學的改變；利用皮層電極觀察大鼠腦電變化；從病理學方面研究海馬神經(jīng)元損傷的變化、苔絲纖維發(fā)芽及膠質細胞形成情況，探討KA致癇機制。
　　 方法：<

2、br>　　 1.應用立體定位側腦室注射給藥的方法建立KA誘導的大鼠顳葉癲癇模型。
　　 2.根據(jù)Racine分級觀察大鼠癲癇發(fā)作行為變化，記錄癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作程度以及持續(xù)時間。
　　 3.利用塵物機能記錄儀監(jiān)測大鼠致癇后24h內(nèi)、7d，45d皮層腦電變化情況。
　　 4.應用Nissl染色法觀察致癇后2h，7d和45d大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)目改變。
　　 6.應用Timm染色法觀察致癇后2h，7d和

3、45d大鼠海馬神經(jīng)元苔蘚纖維出芽狀況和數(shù)目改變。
　　 7.應用免疫組化法觀察致癇后2h，7d和45d大鼠海馬神經(jīng)元GFAP免疫反應陽性的星形膠質細胞數(shù)目改變。
　　 結果：
　　 1.KA注射后大鼠表現(xiàn)典型的顳葉癲癇發(fā)作。
　　 2.KA注射后大鼠雙側皮層可見叢集性棘波放電，并逐漸增多，發(fā)展成爆發(fā)性連續(xù)性棘波發(fā)放，以后逐漸減少。模型建立后1～15d，腦電圖未見異常。
　　 3.對照組大鼠海馬CA

4、1、CA3區(qū)錐體細胞結構清晰完整，細胞核結構正常，染色質分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富，未見明顯神經(jīng)元丟失壞死。
　　 4.對照組大鼠海馬齒狀回內(nèi)分子層，CA3區(qū)錐體細胞層達CA3區(qū)始層有極少數(shù)苔蘚纖維穿過。
　　 5.對照組大鼠、SE2h大鼠在海馬區(qū)僅有弱的GFAP免疫反應陽性的星形膠質細胞。
　　 結論：
　　 1.海人酸側腦室注射可以成功誘發(fā)大鼠顳葉癲癇，該法操作簡便，安全性好，癇鼠存活率高，致癇過程

5、清晰，根據(jù)大鼠行為學和EEG改變可分為急性期、靜息期和慢性期。因此海人酸致癇模型可作為癲癇發(fā)塵機制研究的理想模型。
　　 2.海人酸致癇后可造成海馬神經(jīng)元損傷和苔蘚纖維出芽。
　　 第二部分：FK506改善顳葉癲癇病程及學習記憶能力的實驗研究
　　 目的：
　　 研究免疫抑制劑FK506是否能改善顳葉癲癇的病程、提高顳葉癲癇鼠學習記憶能力；是否對癲癇發(fā)作造成的線粒體超微結構損害有保護作用，從而為臨床應用提

6、供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.應用立體定位側腦室注射給藥的方法建立KA誘導的大鼠顳葉癲癇模型。
　　 2.根據(jù)Racine分級觀察大鼠癲癇發(fā)作行為變化，記錄癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作程度以及持續(xù)時間并觀察應用FK506后癲癇行為的改變。
　　 3.應用水迷宮實驗方法觀察致癇大鼠認知功能的變化，并觀察應用FK506后認知功能改善情況。
　　 4.應用Nissl染色觀察各組大鼠癲癇反復發(fā)作后海馬神經(jīng)元

7、的形態(tài)及數(shù)目改變并觀察FK506的作用。
　　 5.電子透鏡觀察各組大鼠癲癇反復發(fā)作后海馬神經(jīng)元線粒體改變并觀察FK506對線粒體的作用。
　　 結果：
　　 1.KA注射后大鼠表現(xiàn)典型的顳葉癲癇發(fā)作。
　　 2.Morris水迷宮實驗檢測提示FK506可提高顳葉癲癇鼠記憶學習能力。
　　 3.對照組，神經(jīng)元著藍色，深染，神經(jīng)元排列致密整齊，細胞大而圓，核位于中央，尼氏小體位于胞漿。
　　

8、 4.電鏡下KA組CA1、CA3區(qū)可見細胞皺縮，核膜局部崩解，胞質內(nèi)有大量高密度小體積脂肪滴，殘存的神經(jīng)元尼氏小體明顯減少，線粒體腫脹、破碎，整個膜系統(tǒng)出現(xiàn)明顯破壞，神經(jīng)細胞呈現(xiàn)嚴重的壞死改變，線粒體主要表現(xiàn)為3、4級損傷，病變級別為3.89±1.02和4.05±0.26級。
　　 結論：
　　 1.KA注射后大鼠表現(xiàn)典型的顳葉癲癇發(fā)作。
　　 2.FK506改善KA誘導的顳葉癲癇病程，明顯降低癲癇敏感性，使癲癇

9、發(fā)作次數(shù)明顯減少，癲癇最大程度持續(xù)時間明顯縮短。
　　 3.KA誘導的顳葉癲癇大鼠，學習記憶能力明顯降低；FK506可縮短發(fā)現(xiàn)平臺的潛伏期，提高目標象限游泳距離和次數(shù)。
　　 4.FK506可逆轉KA誘導的顳葉癲癇大鼠海馬神經(jīng)元萎縮、壞死和線粒體的破壞，提示FK506對神經(jīng)元變性有保護作用。
　　 第三部分 FK506上調GABA能突觸后膜抑制作用改善癲癇的實驗研究
　　 目的：
　　 探討顳葉癲

10、癇發(fā)作后，海馬CA3錐體神經(jīng)元突觸后膜抑制性電流(IPSC)的變化；觀察癲癇發(fā)作后CaN活性、CaN蛋白表達、GABA受體表達的動態(tài)變化以及相互影響；研究CaN抑制劑FK506抗癲癇作用機制。
　　 方法：
　　 1.應用海人酸側腦室注射方法制作大鼠顳葉癲癇模型。
　　 2.快速取KA組海馬切片，用完整細胞膜片鉗檢測CA3區(qū)錐體神經(jīng)元抑制性突觸后電流的頻率和波幅變化，水浴灌注免疫抑制劑FK506和雷帕霉素，觀察二

11、者對錐體神經(jīng)元IPSC頻率和波幅變化影響。
　　 3.分假手術組、KA組、FK506預防組、FK506治療組，觀察FK506對顳葉癲癇病程的影響；然后取海馬切片，應用對硝基苯酚磷酸鹽脫磷酸化法和Westernblot分析方法測定基礎和最大刺激狀態(tài)下CaN磷酸酶活性和CaN蛋白表達在不同時間的動態(tài)變化。
　　 4.應用Westernblot分析方法，使用抗磷酸絲氨酸/蘇氨酸抗體，測定FK506對顳葉癲癇鼠GABAARβ2/

12、3亞單位磷酸化狀態(tài)影響。
　　 結果：
　　 1.癲癇發(fā)作后，CA3區(qū)錐體細胞IPSC頻率和波幅明顯降低，F(xiàn)K506通過抑制CaN活性提高IPSC頻率和波幅，從而上調GABA能抑制作用。
　　 2.FK506抑制癲癇后海馬區(qū)CaN的活性增強：KA處理組切片顯示CaN磷酸酶活性在基礎和最大刺激狀態(tài)下明顯增加。
　　 3.FK506對癲癇后海馬CA3區(qū)CaN蛋白水平表達影響，提示FK506可抑制癲癇24h后C

13、aN蛋白的表達，對慢性難治性癲癇有抑制作用。
　　 4.FK506抑制GABAA受體脫磷酸化：KA誘導的顳葉癲癇導致GABAA受體β2/3亞單位絲/蘇氨酸殘基脫磷酸化：在SE2h后，GABAARβ2/3亞單位的絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化水平明顯下降，為假手術組的38.2±4.8％，差異有顯著性統(tǒng)計意義；應用FK506可部分抑制GABAA受體脫磷酸化，提高絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化水平。FK506預防組和治療組分別是假手術組的62

14、.7±3.8％和59.3±2.5％，與KA組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。但各組總GABAARβ2/3亞單位水平?jīng)]有明顯改變。提示FK506可逆轉顳葉癲癇所致GABAA受體β2/3亞單位脫磷酸化，控制癲癇發(fā)作。
　　 結論：
　　 1.KA誘導的顳葉癲癇引起海馬CA3區(qū)CaN活性升高和GABAA受體去磷酸化，導致了錐體神經(jīng)元IPCS頻率和波幅迅速降低，突觸后膜抑制作用受到抑制，興奮性升高，癲癇發(fā)作加重。免疫抑制劑FK506通

15、過抑制CaN活性和CaN蛋白表達，提高基礎突觸抑制(IPCS頻率和波幅升高)，上調GABAA受體抑制作用，調節(jié)了顳葉癲癇信號傳導機制，部分抵消KA誘發(fā)的顳葉癲癇，改善癲癇病程。
　　 2.顳葉癲癇早期，CaN蛋白未見明顯變化，癲癇后24小時CaN蛋白才開始表達。提示CaN活性的迅速增加不太可能是CaN蛋白表達迅速增加的結果，而是CaN活性增加或CaN活性動力學改變。而SE后24hCaN蛋白表達增加，提示顳葉癲癇敏感性升高，可能與

16、長期慢性癲癇發(fā)作有關。CaN抑制劑FK506抑制癲癇早期CaN活性升高和癲癇后24小時CaN蛋白表達，為急慢性癲癇的治療提供了理論依據(jù)。
　　 研究意義：
　　 本研究建立紅藻氨酸(kainic acid，KA)誘導的大鼠顳葉癲癇模型，應用行為學方法檢測顳葉癲癇發(fā)作情況以及導致的認知功能障礙；應用Timm染色和免疫組化觀察苔絲纖維發(fā)芽和酸性膠質蛋白變化；應用電子透鏡檢測顳葉癲癇造成的神經(jīng)元線粒體損害并觀察免疫抑制劑FK5

17、06的作用；應用海馬切片全細胞膜片鉗方法記錄CA3區(qū)錐體神經(jīng)元抑制性突觸后電流(IPSC)頻率、波幅變化以及免疫抑制劑FK506和雷帕霉素對錐體神經(jīng)元IPSC頻率和波幅變化的影響，探索IPSC形成機制；應用對硝基苯酚磷酸鹽脫磷酸化法測定基礎狀態(tài)和Mg2+最大刺激狀態(tài)下CaN磷酸酶活性在癲癇發(fā)作后不同時間的動態(tài)變化；應用Westblot方法檢測CaN蛋白表達的動態(tài)變化并判斷CaN活性與CaN蛋白表達的關系，檢測GABAAR和GABAARβ

18、2/3亞單位磷酸化蛋白表達變化以及FK506和雷帕霉素的干預作用。發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇發(fā)作可造成苔絲纖維發(fā)芽、膠質細胞增生和線粒體破壞；首次在活體動物水平和活體外細胞水平證實CaN參與顳葉癲癇發(fā)作的病程。發(fā)現(xiàn)CaN活性在癲癇早期就明顯升高，而CaN蛋白在癲癇發(fā)作后24小時才出現(xiàn)表達，但二者均可促進GABAAR脫磷酸化，下調IPSC，使IPSC頻率和波幅明顯降低，從而提高了癲癇易感性，導致難治性癲癇形成。免疫抑制劑雷帕霉素并不能逆轉IPSC波幅和