褪黑素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的影響.pdf

1、背景：
　　肺癌在全世界各個(gè)國(guó)家發(fā)病率都很高，且轉(zhuǎn)移率死亡率也很高，其早期診斷率低，發(fā)現(xiàn)時(shí)多屬中晚期，雖然治療方法多樣，各種治療方法療效均不佳，5年生存率低。近年來(lái)在體內(nèi)外的研究中發(fā)現(xiàn)褪黑素有明確的抗腫瘤作用。但是關(guān)于褪黑素與肺癌關(guān)系的研究不多。核轉(zhuǎn)錄因子κB是一種重要的細(xì)胞因子，活化后能從胞漿移位進(jìn)入核內(nèi)，與目的DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在腫瘤細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子κB通常處于異?；罨癄顟B(tài)，與腫瘤的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過(guò)

2、程密切相關(guān)，抑制其活性已成為腫瘤治療的方向之一。
　　臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，褪黑素能增強(qiáng)化療療效、提高晚期肺癌患者生存率，但未見(jiàn)相關(guān)的機(jī)制研究。有關(guān)細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子κB的活性有抑制作用，肺癌的研究中未見(jiàn)報(bào)道。我們推測(cè)褪黑素可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB活性來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，因此我們?cè)O(shè)計(jì)在體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞，以不同濃度的褪黑素干預(yù)，觀察細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的情況，明確褪黑素對(duì)非小細(xì)胞肺癌的作用，并測(cè)定轉(zhuǎn)錄

3、因子κB的核移位情況，從而推斷轉(zhuǎn)錄因子κB在褪黑素抗腫瘤過(guò)程中的作用。
　　第一部分：褪黑素對(duì)體外肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響
　　目的：探討褪黑素對(duì)體外肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響，并初步探討其可能的作用路徑。
　　方法：體外培養(yǎng)人肺腺癌 A549細(xì)胞，將細(xì)胞分為5組，分別用含5mmol/L、2.5mmol/L、1mmol/L、0.1mmol/L、0mmol/L的褪黑素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。1、用噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)24h、

4、48h、72h的增殖情況；2、DNA末端原位標(biāo)記染色法（TUNEL）檢測(cè)各濃度褪黑素干預(yù)48h后細(xì)胞凋亡情況；3、免疫組織化學(xué)方法初步判斷各組細(xì)胞干預(yù)48h后核轉(zhuǎn)錄因子κB的核移位情況；4、Western-blot方法測(cè)定各組細(xì)胞干預(yù)48h后抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl2和凋亡相關(guān)蛋白Caspase3表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、高濃度的褪黑素能夠直接抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，低濃度的褪黑素對(duì)增殖無(wú)明細(xì)影響，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)

5、。2、高濃度褪黑素干預(yù)后細(xì)胞凋亡率明顯提高，低濃度無(wú)明顯影響。3、免疫組化結(jié)果顯示，高濃度褪黑素干預(yù)后細(xì)胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κBp65陽(yáng)性率降低。4、褪黑素能夠調(diào)節(jié)Bcl2、Caspase3蛋白的表達(dá)，隨著褪黑素濃度的升高，Bcl2蛋白表達(dá)水平降低、Caspase3表達(dá)水平升高。
　　結(jié)論：褪黑素能夠呈劑量-時(shí)間依賴性的抑制人A549細(xì)胞的體外增殖，作用機(jī)制可能是褪黑素通過(guò)抑制NF-κB的核移位調(diào)節(jié)Bcl2、Caspase3等蛋白的表

6、達(dá)增加細(xì)胞的凋亡率。
　　第二部分：褪黑素與多柔比星對(duì)肺腺癌 A549細(xì)胞的協(xié)同作用及褪黑素對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響
　　目的：探討褪黑素與常用化療藥物多柔比星聯(lián)合用藥對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的作用，并觀察褪黑素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　方法：1、將體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細(xì)胞分為9組，分別用0mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L褪黑素與0ug/ml、0.2ug/ml、2ug/ml多柔

7、比星組合干預(yù)48h，噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定細(xì)胞增殖情況；2、細(xì)胞劃痕法檢測(cè)0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L褪黑素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響；3、Transwell侵襲小室測(cè)定法分析0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L褪黑素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響；4、Western-blot法檢測(cè)0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/

8、L褪黑素對(duì)A549細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Bp65核移位的影響。
　　結(jié)果：1、0.1mmol/L、1mmol/L褪黑素單獨(dú)使用48h對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞無(wú)明顯抑制增殖的作用，與多柔比星合用時(shí)可明顯提高多柔比星對(duì)細(xì)胞的抑制作用。2、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示褪黑素對(duì)細(xì)胞的遷移能力有抑制作用，且呈劑量依賴性。3、Transwell侵襲小室測(cè)定實(shí)驗(yàn)顯示褪黑素對(duì)細(xì)胞的侵襲能力有抑制作用，隨著濃度增加抑制作用增強(qiáng)。4、Western-blot結(jié)果提示褪黑素能