兩個不同致病類型小麥葉銹菌株差異表達分析及其分泌蛋白的篩選.pdf

1、小麥葉銹菌是小麥的重要病原物，防治由該菌引起的小麥葉銹病最有效、經濟、安全的方法是培育抗病品種。開展對小麥葉銹菌致病性差異研究對于揭示小麥葉銹菌致病分子機制及揭示毒性易變區(qū)域，有效利用抗病基因具有重要意義。本試驗采用兩種不同致病類型葉銹菌08-5-361-1(THTT)和09-12-284-1(THTS)，分別接種到感病小麥品種Thacher上，在吸器大量出現時提取接種小麥葉片總RNA，使用IlluminaSolexa(深圳華大基因公司

2、)平臺對兩個RNA樣品（樣品ID分別為Tc284_2和Tc361_1）進行數字表達譜測序。利用生物信息學方法對結果進行分析，尋找候選效應分泌蛋白，為今后分泌蛋白的研究及闡明小麥葉銹菌致病機制奠定基礎。
　　獲得主要結果如下:
　　1、構建了數字表達譜數據庫:對接種葉銹菌小種08-5-361-1、09-12-284-1的Tc樣品測序，分別命名為數據庫Tc284_2和Tc361_1，以已有的數據庫Tc15_2為參考數據庫。樣品T

3、c284_2與參考數據庫比對得到Total BasePairs為353，131，779，TotalReads7,206,771,Total Mapped Reads為2,935,991(40.74％), Unique Match為2，375，423(32.96％)。Tc361_1與參考數據庫的比對得到Total BasePairs344，976，954，Total Reads7,040,346,Total Mapped Reads2,4

4、76,977(35.18％), Unique Match1，994，137(28.32％)。Tc284_2組裝得到19950 unigenes，Tc284_2注釋到KEGG的Unigenes有10593個。注釋到Blast nr的有19138個。注釋到GO數據庫，得到GOProcess條目的有3，296個，GO Function條目6，685個，GO Component條目的有5，633個。Tc361_1組裝得到19，806 unige

5、nes，Tc361_1注釋到KEGG的Unigenes有10,657個。注釋到Blast nr的有18，973個。注釋到GO數據庫，得到GO Process條目的有5，720個，GO Function條目6，739個，GO Component條目的有3，379個。
　　2、以樣品Tc361-1為處理組，以Tc284-2為對照組進行基因差異表達分析，共得到2784個差異基因（差異表達基因為FDR≤0.001且倍數差異不低于2倍的基因

6、），其中1708個上調表達，涉及到MAPK信號途徑、轉錄調控、序列特異的DNA結合轉錄因子活性、小GTP酶介導信號轉導、RNA運輸、基質特異性跨膜運輸活性、賴氨酸降解、核酸結合、鋅離子結合、天冬酰胺合成酶、谷氨酸水解活性、輔酶Q結合、GTP酶活性、ATP解旋酶活性、應激反應等功能。下調基因1076個，注釋到的功能包括ABC轉運系統(tǒng)ATP結合蛋白、分子內轉移酶活性、質子泵運輸和轉運陽離子活性的ATP酶、細胞壁完整性和應激反應組件、錯誤折疊

7、蛋白的異化作用、細胞色素b5還原酶、Lon-ATP結構類似物蛋白酶、絲氨酸肽鏈內切酶活性、有機環(huán)狀化合物結合、金屬離子結合蛋白。
　　3、運用生物信息學方法對差異基因編碼的蛋白進行分析，用signalP篩選得到199個含有信號肽的unigenes，用targetP篩選得到4個定位于線粒體的unigenes，用TMHMM篩選得到40個含有跨膜結構域的unigenes。用big-PI預測到5個unigenes含有GPI錨修飾位點，排除

8、靶標在線粒體的、含有跨膜結構域的、含有GPI錨定位點的蛋白，確定差異表達的分泌蛋白共150個。其中相對于Tc284-2，Tc361-1有上調表達的分泌蛋白92個，有下調表達的58個。在Tc284-2中特異表達的分泌蛋白為Unigene11683_Tc15_2、Unigene11935_Tc15_2，在Tc361-1中特異表達分泌蛋白分別是CL4323.Contig1_Tc15_2、CL5606.Contig1_Tc15_2和Unigen

9、e26432_Tc15_2。這些分泌蛋白均為功能未知的蛋白。
　　4、在分泌蛋白的基礎上進一步使用Pfam對蛋白骨架和功能域進行預測，得到注釋的分泌蛋白有36個。剩余的114個分泌蛋白使用MEME軟件進行de novo結構篩選和預測，結果在15個分泌蛋白中預測到3個保守結構域，分別是motif1(YxxxxNKxDC)、motif2(Y[N/A]Y[T/D][H/A][C/A][S/H][T/Q][S/N][S/G][N/C]T[