人肝細胞型體外生物人工肝支持系統(tǒng)的實驗研究.pdf

1、各種原因導致的肝衰竭十分常見，內科綜合治療療效差.人工肝支持系統(tǒng)是治療肝衰竭的重要方法之一，以培養(yǎng)肝細胞為核心的生物人工肝可暫時替代肝臟功能，清除有害物質，補充生物活性物質。目前用于臨床研究的肝細胞材料主要有豬肝細胞、從HepG2細胞獲得的C3A細胞系。采用C3A細胞的ELAD生物人工肝臨床研究顯示對肝衰竭患者有一定療效，但治療過程中有出血、過敏，凝血等不良反應.為完善肝細胞的功能，本課題將人肝再生增強因子(hALR)應用于生物人工肝細

2、胞材料中，構建體外生物人工肝支持系統(tǒng)(BLASS)，以期增強肝細胞分泌肝再生增強因子的能力，提高生物人工肝的療效。
　　 1.pcDNA3.1(-)hALR重組質粒的構建及鑒定ALR是一種熱穩(wěn)定細胞因子，它能促進肝細胞增殖和肝臟再生、抑制NK細胞活性，對受損的肝細胞具有很強的保護作用.本試驗從肝組織中提取RNA，RT-PCR擴增出hALR片段，克隆至真核表達載體pcDNA3.1(-)，構建重組質粒pcDNA3.1(-)hALR，

3、經(jīng)測序、雙酶切等方法鑒定，符合應用要求。
　　 2.hALR肝細胞系的建立及功能評價采用有限稀釋法和利多卡因轉化等方法篩選HepG2細胞，挑選出一株生長旺盛、有一定利多卡因代謝功能的細胞，然后轉染重組質粒pcDNA3.1(-)hALR，經(jīng)G418篩選，在體外培養(yǎng)50代后，進一步對其合成、代謝、解毒等功能評價.結果顯示：該細胞系功能穩(wěn)定，形態(tài)良好，生長旺盛，24h利多卡因轉化率65％，安定轉化率79.33％。間接免疫熒光實驗證實h

4、ALR在肝細胞胞漿中大量存在。轉染后的肝細胞生長速度、白蛋白合成能力等均較轉染hALR之前肝細胞有所增強。培養(yǎng)72h后，肝細胞上清液中AFP可升高至118.0±56ng/ml.免疫斑點印跡法檢測到其培養(yǎng)上清液中ALR蛋白水平升高。另外該肝細胞系可在體外大量、快速增殖，基本符合生物人工肝細胞材料的要求。
　　 3.hALR肝細胞系的生物反應器培養(yǎng)用已建立的hALR肝細胞系為細胞材料，以費森尤斯公司的P2S血漿濾過器為中空纖維反應器

5、，反應器中預先裝入存活率95％以上、總量1×108個肝細胞。用管路連接蠕動泵、肝細胞培養(yǎng)液等，構建生物反應器體外培養(yǎng)系統(tǒng)，對肝細胞在反應器中的生長及功能進行評估.結果發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)保持完整，并有一定的合成白蛋白、甲胎蛋白、尿素氮等作用.培養(yǎng)72h后細胞數(shù)升至7.60×108，96h后為9.02×108，細胞存活率分別為92％和95％，在倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察下可見細胞能較好粘附在中空纖維上.24h利多卡因轉化率88.4％，細胞培養(yǎng)液的細

6、菌和支原體檢測均未發(fā)現(xiàn)異常。
　　 4.離線型生物人工肝支持系統(tǒng)的構建及對肝衰竭患者血漿體外治療的初步研究我們采用“離線”方法，在體外對血漿置換后廢棄血漿進行膽紅素吸附，然后采用血漿代替培養(yǎng)液，對生物反應器中hALR肝細胞進行培養(yǎng)，充分利用肝細胞的代謝、解毒和合成功能。結果顯示：治療前血漿TBil為332.22±22.54umol/L，膽紅素吸附后TBil為295.6±128.7μmol/L(P<0.01)，白蛋白、BUN、血糖

7、等變化無顯著性差異。離線生物人工肝治療前血漿中TBil、AFP和白蛋白值分別是295.6±128.7μmol/L，21.2士17.5ng/ml和26.44±2.186 g/L，經(jīng)4～6h治療后，上述指標分別為239.4±103.9μmol/L(P<0.05)，102±62.8ng/ml(P<0.01)和32.44±2.29g/L(P<0.05)。結果提示本離線型生物人工肝支持系統(tǒng)具有降低膽紅素，增加白蛋白、尿素、AFP的合成等作用。