人類皰疹病毒8型（HHV-8）在廣州地區(qū)獻血人群中的感染情況調(diào)查及K13基因的原核表達體系的構(gòu)建.pdf

1、研究背景和目的:人類皰疹病毒8型(humanherpesvirus8，HHV-8)，又稱卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi'ssarcoma-associatedherpesvirus，KSHV)，是Chang等于1994年在一例艾滋病患者的卡波氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma，KS)組織中用代表性差異分析方法(representativedifferenceassay)發(fā)現(xiàn)并鑒定的一種新型皰疹病毒。隨后的研究發(fā)現(xiàn)HHV-8存在

2、于所有類型的KS組織中(包括經(jīng)典型、艾滋病相關(guān)型、地方型和醫(yī)源型KS)，并認為是KS發(fā)生的條件之一。HHV-8還與原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primaryeffusionlymphoma，PEL)，多中心性卡斯特萊曼病(multicentricCastleman'sdisease，MCD)的發(fā)病密切相關(guān)。 HHV-8的感染率在不同的地區(qū)及用不同的血清學(xué)方法所檢測的結(jié)果不盡相同。由于缺乏血清學(xué)診斷的“金”標準，所得的結(jié)果不一定都能反映真

3、實情況，但基本上都反映了相似的趨勢，即與KS的發(fā)病率存在平行關(guān)系。目前我國尚無大規(guī)模普通人群，特別是無償獻血人群的HHV-8感染率的報道。本研究首次對廣州地區(qū)3135名無償獻血者進行了血清流行病學(xué)調(diào)查，并用巢式PCR法對廣州地區(qū)500名無償獻血者進行了外周血單核細胞中HHV-8DNA的檢測。 HHV-8基因組為線性雙鏈DNA，有一長約140.5kb的獨特編碼區(qū)(uniquecodingregion)，編碼至少85個開放讀碼框架(

4、openreadingframes，ORFs)，包括15個為HHV-8特有的ORFs，K13即為其中之一。 盡管做了大量的研究，目前仍未建立標準的HHV-8血清學(xué)診斷方法，主要的原因之一是對哪些病毒蛋白可作為抗原用于檢測還未完全了解。HHV-8在普通健康人群中存在一定的感染率，而且病毒通常以潛伏感染狀態(tài)長期存在于人體。對病毒潛伏感染的檢測在調(diào)查普通人群感染率時顯得尤為重要，且同時使用潛伏期和裂解期蛋白檢測血清中的抗體可以提高檢測

5、的敏感性。K13基因編碼的vFLIP(viralFas-associateddeathdomainIL-β-convertingenzyme(FLICE)inhibitoryprotein)蛋白是病毒主要潛伏期蛋白之一，體外克隆和表達潛伏基因是建立HHV-8潛伏感染檢測方法的基礎(chǔ)。本研究構(gòu)建了pGEX-4T-1/K13重組質(zhì)粒大腸桿菌表達體系，實現(xiàn)目的蛋白的體外表達，并對目的蛋白的抗原性進行分析。 材料和方法:1.3135份血漿

6、及500份全血來自2004年10月至2005年3月在廣州市參加無償獻血的人群，均經(jīng)過金標HBsAg快速試紙條初篩合格。 2.HHV-8IgGELISAKit(ABI，USA)檢測3135份血漿抗HHV-8IgG抗體。 3.500份全血基因組DNA抽提用TaKaRaMiniBESTBlood&CulturedCellGenomicDNAExtractionKitVer.2.0試劑盒抽提基因組DNA。 4.巢式PCR

7、擴增以KS4/KS5為外對引物，KSl/KS2為內(nèi)對引物做巢式PCR，陽性PCR產(chǎn)物直接測序。 5.K13蛋白的原核表達及抗原性分析將質(zhì)粒pGEX-4T-l和HHV-8K13基因分別用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，純化連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-l/K13。重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/K13經(jīng)酶切和測序鑒定后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，以異丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達融和蛋白，對表達的融合

8、蛋白進行SDS-PAGE和Western-Blot分析。 結(jié)果:1.3135名獻血者中有6名在血漿標本中檢測出HHV-8IgG抗體陽性，均為漢族、男性獻血員，總陽性率為0.19％。 2.500名獻血者中有2名在外周血單核細胞中檢測出HHV-8DNA，均為漢族、男性獻血員，總陽性率為0.4％。 3.構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/K13，實現(xiàn)了目的蛋白的體外表達。SDS-PAGE分析顯示目的蛋白條帶分子量約為47

9、kDa，與理論值相符。Western-Blot分析表明目的蛋白不能被HHV-8IgG抗體陽性的血漿識別。 結(jié)論:1.廣州地區(qū)無償獻血者HHV-8的感染率較低，而且目前對HHV-8的致病性、傳播方式等方面了解還不全面，標準的診斷方法尚未建立，故目前無需對廣州地區(qū)獻血者進行HHV-8的檢測。 2.構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/K13，成功地在體外表達了重組融合蛋白，Western-Blot證實重組融合蛋白不能被HHV-8