瘦素信號(hào)通路對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:瘦素信號(hào)通路缺失(瘦素抵抗)是二型糖尿病的并發(fā)癥之一,現(xiàn)有的研宄顯示,中樞和外周途徑的瘦素信號(hào)對(duì)骨量、脂肪含量都有較為明顯的影響。但瘦素信號(hào)對(duì)于兩種不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞作用是否相同,與之相關(guān)的作用靶點(diǎn)是什么卻不甚了解。本研宄旨在對(duì)瘦素信號(hào)在不同來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞中的具體作用方式及靶點(diǎn)進(jìn)行探索,為解釋兩種不同靶器官對(duì)于瘦素信號(hào)的應(yīng)答提供依據(jù)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)一:對(duì)瘦素缺失小鼠組(ob/ob),瘦素受體缺失小鼠組(db/db),

2、正常野生型小鼠組(WT),重組瘦素恢復(fù)瘦素缺失小鼠瘦素信號(hào)組(ob/ob+1印tin)進(jìn)行骨形態(tài)學(xué)、成骨和破骨細(xì)胞功能、體內(nèi)白色脂肪含量、攝食量的測(cè)定。確定瘦素信號(hào)缺失對(duì)于兩種器官(組織)生理功能的影響。
　　實(shí)驗(yàn)二:以酶消化法和全骨髓法培養(yǎng)脂肪來(lái)源和骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定表面分子,分組同前。MTT、克隆形成能力試驗(yàn)(CFUassay)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,成骨、成脂分化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)分化能力。PCR與

3、 Western Blot檢測(cè)相關(guān)基因與蛋白水平的變化。
　　實(shí)驗(yàn)三:對(duì)細(xì)胞體外進(jìn)行PPARy信號(hào)與AMPK信號(hào)的激活,觀察細(xì)胞成脂成骨能力的變化及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一、MicroCT通過(guò)股骨遠(yuǎn)端骨密度(BMD)、骨量/組織量(BV/TV)、骨小梁粗細(xì)(Tr.Th)、骨小梁數(shù)量(T r.N)骨小梁間距(Tr.S)等骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測(cè)提示ob/ob小鼠均明顯高于WT小鼠且WT小鼠高于db/db小鼠。HE染

4、色、新骨形成率(BFR)、抗酒石酸酸性磷酸酶活性(TRAP)、血清成骨破骨標(biāo)志物檢測(cè)提示相同趨勢(shì)。骨髓腔油紅0染色提示瘦素信號(hào)缺失(Iep-/-)小鼠的骨髓腔內(nèi)有較多脂滴形成。骨長(zhǎng)度、皮質(zhì)骨密度檢測(cè)提不Iep-/-小鼠較WT小鼠有明顯的下降。Iep-/-小鼠的體重和相關(guān)白色脂肪、攝食量均較WT小鼠有明顯的增加,瘦素信號(hào)的恢復(fù)對(duì)體重的改變是明顯的。
　　實(shí)驗(yàn)二、分離的脂肪與骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)流式表面分子鑒定符合干細(xì)胞特征。MT

5、T實(shí)驗(yàn)、克隆形成能力提示瘦素信號(hào)的缺失方式不同會(huì)影響骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖能力,克隆形成集落骨向分化能力實(shí)驗(yàn)(CFU-O)提示三種來(lái)源細(xì)胞無(wú)明顯差異,而克隆形成集落脂向分化能力實(shí)驗(yàn)(CFU-A)顯示:1印-/-小鼠明顯強(qiáng)于WT小鼠。而脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)方面,增殖分化相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示I印-/-來(lái)源的ADSCs增殖能力較強(qiáng)、成骨分化能力較弱而成脂分化能力較強(qiáng)。相關(guān)基因蛋白的結(jié)果與染色結(jié)果一致。重組瘦素可以恢復(fù)

6、瘦素缺失的MSCs的生物學(xué)行為異常。
　　實(shí)驗(yàn)三:PPARy激活劑羅格列酮可明顯增強(qiáng)WT來(lái)源ADSCs的脂向分化能力,卻對(duì)瘦素信號(hào)缺失的ADSCs作用甚微;AMPK激活劑二甲雙胍對(duì)不同來(lái)源的BMSCs增強(qiáng)成骨分化能力的作用一致。重組瘦素可扭轉(zhuǎn)羅格列酮對(duì)MSCs成脂分化過(guò)程影響的差異,卻對(duì)二甲雙胍造成的成骨能力上升無(wú)明顯作用。
　　結(jié)論:1、瘦素信號(hào)通路的缺失對(duì)小鼠長(zhǎng)骨的骨量有明顯的影響,但瘦素缺失與其受體缺失所起的作用不完全

7、相同,提示除外周循環(huán)條件下瘦素的直接作用以外,可能存在瘦素于中樞交感神經(jīng)的信號(hào)對(duì)骨量存在作用且是主要作用的可能。且瘦素對(duì)發(fā)育期的骨形成有較為明顯的影響。瘦素對(duì)小鼠體內(nèi)白色脂肪生成的刺激作用兩種不同的信號(hào)缺失方式較一致。
　　2、ob/ob小鼠的骨量上升是一種高成骨和高破骨的高轉(zhuǎn)換型骨量上升;db/db小鼠的骨質(zhì)疏松是一種低成骨和低破骨共同作用的低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松。
　　3、瘦素信號(hào)對(duì)BMSCs的增殖能力、成脂分化能力影響明顯,