豬2型圓環(huán)病毒ELISA診斷方法及豬2型圓環(huán)病毒-偽狂犬病病毒二價(jià)基因工程疫苗研究.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒(PCV2)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物病毒之一，該病毒與豬的多種疾病綜合征有關(guān)，特別是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征，該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、呼吸道癥狀、發(fā)熱、蒼白及黃疸等，病原學(xué)及血清學(xué)調(diào)查表明，該病在許多國(guó)家都廣泛存在，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了了解PCV2在我國(guó)的流行現(xiàn)狀以及研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防制，本研究對(duì)PCV2ELISA診斷方法及PCV2-PRV

2、二價(jià)基因工程疫苗進(jìn)行了研究，主要研究?jī)?nèi)容如下： 1.PCV2ORF2基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)采用PCR方法從包含PCV2全基因組的重組質(zhì)粒pT-PCV中擴(kuò)增PCV2ORF2基因的完整編碼區(qū)，將其克隆到pMD18-T載體后，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pTORF2，經(jīng)序列測(cè)定證實(shí)，該基因未發(fā)生任何堿基突變。已有報(bào)道證實(shí)ORF2蛋白N端41aa是其在細(xì)胞內(nèi)的核定位信號(hào)，為了克服全長(zhǎng)ORF2基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)表達(dá)量低或不表達(dá)的缺陷，我們

3、采用酶切方法截去了ORF2基因5’-端的部分核定位序列，并對(duì)截短后的ORF2片斷進(jìn)行了表達(dá)。具體方法是用BalⅠ和SalⅠ雙酶切pTORF2，回收含ORF2基因的小片段，并將其插入pGEX-KG原核表達(dá)載體的SmaⅠ和SalⅠ位點(diǎn)之間，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-ORF2，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后GST-ORF2融合蛋白得到了表達(dá)，大小與預(yù)期結(jié)果相符，且表達(dá)蛋白可與PCV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)，具有免疫學(xué)活性。

4、 2.PCV2ELISA診斷方法的建立及應(yīng)用SDS-PAGE分析表明，GST-ORF2融合蛋白在細(xì)菌裂解液的上清及沉淀中均存在，但主要位于裂解液的上清中，因此我們采用兩種方法分別對(duì)沉淀和上清中的融合蛋白進(jìn)行了提取。對(duì)于沉淀中的包涵體，我們選用十二烷基肌氨酸鈉(SKL)對(duì)包涵體進(jìn)行溶解，并通過(guò)TE(pH8.0)透析復(fù)性獲得有活性的融合蛋白。對(duì)于上清中的可溶性蛋白，我們采用谷胱苷肽瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，結(jié)果表明用該方法提取的融合蛋白純度很高

5、，但獲得量較低。 為了確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)，我們對(duì)GST-ORF2可溶性蛋白和包涵體蛋白分別進(jìn)行了方陣滴定，結(jié)果表明可溶性蛋白與標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清的非特異性反應(yīng)較低，更適宜用作診斷抗原。但考慮到包涵體蛋白提取費(fèi)用低，且在對(duì)陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行稍高倍數(shù)稀釋時(shí)可以降低非特異性反應(yīng)，從而達(dá)到與可溶性蛋白相當(dāng)?shù)脑\斷效果，因此我們選用GST-ORF2包涵體蛋白為ELISA方法的包被抗原。按照方陣滴定確定的抗原最佳包被濃度(1.

6、23μg/mL)包被酶標(biāo)板，建立PCV2ELISA診斷方法，并對(duì)其進(jìn)行了特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法特異性、重復(fù)性良好，且在4℃可以保存至少12個(gè)月。與PCV2間接免疫熒光試劑盒的對(duì)比試驗(yàn)表明，二者的陽(yáng)性符合率為90.3％，陰性符合率為94.4％，總符合率為91.8％，由此可見(jiàn)，二者的符合率較高。在此基礎(chǔ)上，我們用該ELISA方法對(duì)臨床送檢血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明送檢血清中PCV2陽(yáng)性率很高，并且隨著豬體年齡的增長(zhǎng)，PCV

7、2陽(yáng)性率逐漸升高。 3.表達(dá)PCV2ORF1和ORF2基因的重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建將經(jīng)PCR方法擴(kuò)增的ORF2全基因插入到PRVgG-缺失通用轉(zhuǎn)移載體pgG-Uni的多克隆位點(diǎn)中，從而構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pgGORF2。然后再將該質(zhì)粒與PRVTK-/gG-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，病變后經(jīng)空斑純化得到重組病毒TK-/gG-/ORF2+。同理，將ORF1及截去核定位序列的ORF2插入到gE-/gI-雙缺失通用轉(zhuǎn)移載體pIE

8、CMV的多克隆位點(diǎn)中，從而構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIEORF1-ORF2，并與PRVTK-/gE-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，病變后經(jīng)空斑純化得到重組病毒TK-/gE-/gI-/ORF1-ORF2+。通過(guò)Southernblotting鑒定重組病毒，并通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)或Westernblotting檢測(cè)重組病毒中外源基因的表達(dá)，結(jié)果表明重組病毒構(gòu)建正確，且外源基因得到了正確表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)重組病毒的TCID50進(jìn)行了測(cè)定

9、，結(jié)果表明外源基因的插入不影響重組病毒在IBRS-2細(xì)胞上的增殖。 4.PCV2-PRV二價(jià)基因工程疫苗對(duì)小鼠和斷奶仔豬的免疫原性試驗(yàn)將重組病毒按疫苗生產(chǎn)程序制成疫苗，并研究二價(jià)基因工程疫苗對(duì)小鼠和斷奶仔豬的免疫原性試驗(yàn)。小鼠試驗(yàn)結(jié)果表明，TK-/gG-/ORF2+誘導(dǎo)的PRV中和抗體與其親本株TK-/gG-/LacZ+抗體水平相當(dāng)，而TK-/gE-/gI-/ORF1-ORF2+誘導(dǎo)的PRV中和抗體低于其親本株TK-/gE-/L

10、acZ+的抗體水平，但這兩種疫苗免疫鼠都能完全抵抗致死劑量PRV強(qiáng)毒的攻擊，具有與親本株疫苗相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)效果。對(duì)PCV2抗體檢測(cè)結(jié)果表明，兩種二價(jià)基因工程疫苗都只能誘導(dǎo)產(chǎn)生較低水平的ELISA抗體。在小鼠試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們開(kāi)展了二價(jià)基因工程疫苗TK-/gE-/gI-/ORF1-ORF2+對(duì)斷奶仔豬的免疫原性試驗(yàn)。對(duì)PRV的檢測(cè)結(jié)果表明，TK-/gE-/gI-/ORF1-ORF2+誘導(dǎo)的PRV中和抗體也低于PRV三缺失疫苗TK-/gE-