1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立.pdf

1、研究背景和目的：
　　 丙型肝炎病毒(HCV)引起的急、慢性肝病表現(xiàn)為很寬的臨床譜，從癥狀輕微到肝功能衰竭，慢性丙型肝炎患者有20％-30％在10-30年后將進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌。目前全球約有一億八千萬(wàn)人口感染HCV。HCV的流行率高，慢性化率高，抗HCV篩查不能可靠的避免其經(jīng)輸血途徑傳播，又無(wú)疫苗預(yù)防。丙型肝炎治療的關(guān)鍵是抗病毒治療，國(guó)際上公認(rèn)的治療方案為:聚乙二醇化干擾素(PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林，平均持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率(

2、SVR)為56％左右。研究發(fā)現(xiàn)不同的基因型抗病毒治療方案、療程不同，且抗病毒治療的應(yīng)答率也存在差異。如HCV1b型患者應(yīng)用PEG-IFNα與利巴韋林(1000mg/d)聯(lián)合治療至少需要48周，SVR約為15％-50％;HCV2/3型患者應(yīng)用PEG-IFNα與利巴韋林(800mg/d)聯(lián)合治療僅僅需要24周，SVR約為80％。我國(guó)主要的HCV流行基因型為1b型，但值得注意的是，即使均為HCV1b型感染者，對(duì)干擾素治療的結(jié)果也可截然不同。部

3、分HCV1b型患者經(jīng)抗病毒治療后可達(dá)到SVR甚至痊愈，另一部分則療效極差。雖然近期兩個(gè)新型的蛋白酶抑制劑Boceprevir和Telaprevir已經(jīng)被批準(zhǔn)用于臨床，但其遠(yuǎn)期療效還有待評(píng)價(jià)。因?yàn)镠CV感染呈現(xiàn)慢性、隱匿的特點(diǎn)，隨著病程的進(jìn)展，丙肝相關(guān)性終末期肝病患者的數(shù)量在未來(lái)二十年內(nèi)將繼續(xù)增長(zhǎng)，迄今仍是世界性的醫(yī)學(xué)、社會(huì)難題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為何部分HCV1b型患者對(duì)抗病毒治療反應(yīng)良好，能夠痊愈，另一些則反之？究竟哪些因素與丙型肝炎患者抗病

4、毒治療療效預(yù)測(cè)的關(guān)系密不可分？如何更有效、更合理地使用干擾素進(jìn)行抗病毒治療、提高丙肝抗病毒治療的療效？這是目前慢性丙型肝炎患者抗病毒治療研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 HCV是單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科，全長(zhǎng)約9.6kb，包括一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框及兩側(cè)的5'和3'非編碼區(qū)，可以編碼約3000個(gè)氨基酸的前體多聚蛋白。翻譯后，前體多聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成10個(gè)具有獨(dú)立功能的HCV蛋白，根據(jù)功能的不同分為結(jié)構(gòu)蛋白(C、E1

5、、E2、p7)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。因?yàn)镠CV所依賴的RNA聚合酶缺乏校正功能，其基因組序列呈高度異質(zhì)性，不同的分離株在全基因序列上差異達(dá)30％-35％。一直以來(lái)，由于缺乏實(shí)用的動(dòng)物模型和有效的HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，嚴(yán)重影響了HCV復(fù)制機(jī)制、疫苗研制及新HCV防控策略的研究。
　　 1999年，HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)研究取得了階段性進(jìn)展，Lohmann等構(gòu)建了帶新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因

6、作為篩選標(biāo)志的HCV亞基因組(刪除了結(jié)構(gòu)基因，從C到NS2及P7)復(fù)制子，這是一個(gè)雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，第一個(gè)順?lè)醋佑蒆CVIRES引導(dǎo)，第二個(gè)順?lè)醋?NS2-5B)由插入的腦心肌炎病毒(EMCV)IRES引導(dǎo)。用體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，在硫酸新霉素(G418)的篩選下，獲得了少數(shù)細(xì)胞克隆。復(fù)制子剛轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，其復(fù)制子水平較低，隨著不斷傳代，其RNA復(fù)制水平明顯提高，經(jīng)序列分析表明高復(fù)制的復(fù)制子發(fā)生了較多的適應(yīng)性突變。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重要

7、的適應(yīng)性突變有10余處，散布于整個(gè)多蛋白編碼區(qū)，尤其以表達(dá)病毒RNA聚合酶的NS5A區(qū)較集中，且不同的適應(yīng)性突變具有協(xié)同效應(yīng)。適應(yīng)性突變是復(fù)制子在特定細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)取得成功的關(guān)鍵之一，它通過(guò)增強(qiáng)宿主細(xì)胞活化分子與其結(jié)合以及去除細(xì)胞抑制因子與其相互作用而有利于復(fù)制子的復(fù)制和表達(dá)。隨后，一些其他基因型的HCV復(fù)制子，如HCV1a(H77)、2a(JFH1)等復(fù)制子均被報(bào)道。復(fù)制子部分揭示了HCV與宿主細(xì)胞間復(fù)雜的相互關(guān)系，對(duì)HCV的基礎(chǔ)研究和抗

8、病毒藥物篩選具有重要意義，特別是在新的抗HCV藥物如NS3與NS4蛋白酶抑制劑、NS5B多聚酶抑制劑的研發(fā)中的發(fā)揮了重要作用。然而由于不含結(jié)構(gòu)基因，非結(jié)構(gòu)基因復(fù)制子在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中不能產(chǎn)生完整的HCV顆粒，難以滿足深入研究HCV生物學(xué)特點(diǎn)、特別是針對(duì)結(jié)構(gòu)基因的保護(hù)性抗原的鑒定和疫苗研制，以及全方位篩選抗病毒藥物的需要。因此，很多研究者致力于建立一個(gè)可以產(chǎn)生感染性HCV病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
　　 2005年，Wakita等、Z

9、hong等和Lindenbach等分別成功地建立了HCV2a型全長(zhǎng)基因體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。而且由此產(chǎn)生的病毒顆粒可在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)傳代而感染性不會(huì)減低，獲得了穩(wěn)定的、可產(chǎn)生高效感染性體外培養(yǎng)系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，HCV細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展并廣泛的應(yīng)用于相關(guān)研究中。雖然近年來(lái)這些方面的研究有很大進(jìn)展，但是仍然有很多亟待解決的問(wèn)題。目前已經(jīng)建立的有效地HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)，基本都是在JFH1(2a型)毒株的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，而我國(guó)丙型肝炎的

10、主要流行毒株是1b型，與國(guó)外建立的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)所用的HCV基因型不同。HCV1b型全基因細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)難點(diǎn)較多，研究進(jìn)展較緩慢，但不少學(xué)者也在此方面做了很大努力。2005年，HellerT等構(gòu)建了HCV1b基因型全長(zhǎng)cDNA，兩端加有核酶后克隆至真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Huh7.5細(xì)胞，可以檢測(cè)到病毒的復(fù)制，蛋白的表達(dá)，并能夠獲得感染性病毒顆粒，但是該系統(tǒng)產(chǎn)生的病毒顆粒感染性很不理想。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者將含1b型HCV全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒和高效表達(dá)

11、T7RNA聚合酶的vTF7-3共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)vTF7-3表達(dá)T7RNA聚合酶的輔助作用，可使細(xì)胞高效產(chǎn)生HCVRNA，并發(fā)現(xiàn)病毒顆粒的產(chǎn)生。但該系統(tǒng)生產(chǎn)的重組HCV顆粒中含有痘病毒的污染，給病毒顆粒的分離純化帶來(lái)不便，且vTF7-3也有一定的細(xì)胞毒性，在以痘病毒為輔助病毒的體系中，細(xì)胞很快死亡，故在每次培養(yǎng)HCV是，都須重復(fù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和感染痘病毒等操作，過(guò)程繁瑣，實(shí)驗(yàn)安全性也存在一定的隱患。此外，這兩個(gè)體系都需要輔助質(zhì)

12、粒或重組病毒提供凡是啟動(dòng)子激活物和加工因子，HCV核算的初始復(fù)制也非RNA病毒復(fù)制的自然狀態(tài)，而是以質(zhì)粒DNA為模板的轉(zhuǎn)錄，故最為HCV復(fù)制機(jī)制和抗HCV藥物的篩選平臺(tái)，其作用受到限制。至今，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到關(guān)于HCV1b型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)完全成功的報(bào)道。
　　 本研究旨在通過(guò)HCV完整半基因組擴(kuò)增測(cè)序的方法分析病毒基因變異對(duì)PEG-IFN聯(lián)合利巴韋林治療1b亞型慢性丙型肝炎療效的影響，試圖闡明病毒基因組變異對(duì)干擾素療效方面發(fā)揮的作用;

13、并在此基礎(chǔ)上，用已發(fā)生適應(yīng)性突變的HCV1b復(fù)制子來(lái)插入HCV1b結(jié)構(gòu)基因以建立我國(guó)流行株1b型全基因HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，為我國(guó)丙型肝炎發(fā)病機(jī)制的研究，HCV結(jié)構(gòu)基因中保護(hù)性抗原的鑒定及疫苗的研制、研發(fā)抗HCV新藥和新療法、高通量篩選已見(jiàn)臨床療效的藥物、藥物單體，探索新的聯(lián)合用藥方案以提高療效，并闡明療效機(jī)制提供良好的平臺(tái)。
　　 第一章，HCV5'端半基因組的擴(kuò)增及其序列變異對(duì)PEG-IFN/RBV治療1b亞型CHC療效的影響

14、
　　 研究方法：
　　 收集慢性丙型病毒性肝炎患者治療前血清標(biāo)本，納入研究的61例患者診斷符合《丙型肝炎防治指南》抗病毒治療標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均為1b型HCV病毒感染，并完成PEG-IFN聯(lián)合RBV抗病毒治療48周且隨訪24周，其中獲得持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答(SVR組)的患者35例，未獲得持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答(Non-SVR組)的患者26例。采用長(zhǎng)片段RT-PCR法擴(kuò)增包括完整核心蛋白至NS3蛋白的HCV5'端5.2kb半基因組序列

15、，測(cè)序后分析病毒基因組序列變異與抗病毒療效之間的關(guān)系。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn);SVR組和NR組總氨基酸變異個(gè)數(shù)和特異性氨基酸變異個(gè)數(shù)的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn);而特異性變異占總氨基酸變異的百分比使用x2檢驗(yàn)。兩組熵值的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn);平均基因組距離采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P值小于0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS13.0軟件。

16、　　 結(jié)果：
　　 中國(guó)患者治療前HCV的氨基酸變異情況可以影響PEG-IFN/RBV治療1b亞型CHC的療效。我們分別比較了兩組患者1b型HCV半基因組氨基酸變異總數(shù)和特異性氨基酸變異情況，中國(guó)CHC患者治療前體內(nèi)病毒氨基酸的變異性與抗病毒療效相關(guān)，且氨基酸變異主要集中在p7，NS2和NS3蛋白。SVR組患者P7、NS2和NS3蛋白的特異性氨基酸變異個(gè)數(shù)(P=0.036，P＜0.001和P=0.006)、特異性氨基酸變異的比

17、例(P＜0.001，P＜0.001和P＜0.001)、熵值((P=0.019，P=0.023和P=0.046)以及基因組距離((P＜0.001，P＜0.001和P=0.011)均顯著高于Non-SVR組。
　　 第二章，HCV1breplicon細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
　　 研究方法：
　　 我們以兩個(gè)獲贈(zèng)的1b復(fù)制子質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建在Huh7.5.1細(xì)胞內(nèi)能夠長(zhǎng)期、穩(wěn)定、高拷貝復(fù)制的亞基因組復(fù)制子細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。其一

18、是1b-G復(fù)制子質(zhì)粒，該復(fù)制子含有HCVCon1分離株NS3-NS5B非結(jié)構(gòu)基因的cDNA序列，在NS5A區(qū)含S2204I適應(yīng)性突變。其二是1b-H復(fù)制子質(zhì)粒，該復(fù)制子與1b-G相比，在新霉素抗性基因的上游插入了一個(gè)熒光素酶報(bào)告基因以方便檢測(cè)，且其適應(yīng)性突變位于NS3區(qū)的E1202G和T1280I，以及NS4B區(qū)的K1846T。具體方法是，將ScaI酶切的線性化1b-H復(fù)制子和1b-G復(fù)制子質(zhì)粒為模板，在T7RNA聚合酶的作用下，體外轉(zhuǎn)

19、錄出復(fù)制子RNA，然后將此RNA轉(zhuǎn)染至Huh7.5.1細(xì)胞，以含800μg/mlG418的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，根據(jù)克隆形成情況對(duì)克隆進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后用RT-PCR、間接免疫熒光、WesternBlot和熒光素酶檢測(cè)等方法對(duì)克隆細(xì)胞中的HCV核酸和蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 用1b-H和1b-G復(fù)制子轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞后，都獲得了G418抗性克隆，并在最終分離出的細(xì)胞克隆中，檢出HCV復(fù)制子特異性的RNA和NS

20、5A蛋白。由于1b-H復(fù)制子中含有熒光素酶報(bào)告基因，我們通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)活性來(lái)分析病毒的復(fù)制水平，代替繁瑣的RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)方法，較好地方便了實(shí)驗(yàn)研究。
　　 第三章，我國(guó)丙型肝炎流行株1b型全基因HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
　　 研究方法：
　　 選取兩例“難治性丙肝”患者血清，擴(kuò)增HCV5'端半基因組序列并構(gòu)建克隆，選取15-20個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序分析病毒準(zhǔn)種的優(yōu)勢(shì)株;選取優(yōu)勢(shì)克隆株質(zhì)

21、粒，通過(guò)重疊延伸PCR的方法引入合適的酶切位點(diǎn)，再通過(guò)酶切連接的方法，以完整的Core-NS2區(qū)基因替換復(fù)制子中的外源性基因序列，從而構(gòu)建HCV1b全長(zhǎng)cDNA重組質(zhì)粒;然后將全長(zhǎng)cDNA克隆經(jīng)ScaI酶切線性化，在T7RNA聚合酶作用下體外轉(zhuǎn)錄制備全長(zhǎng)HCVRNA，并轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞，熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞上清和細(xì)胞內(nèi)HCVRNA，WesternBlot方法檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)，間接免疫熒光法檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)以及含病毒細(xì)

22、胞上清的感染性。
　　 結(jié)果：
　　 本研究在1breplicon的基礎(chǔ)上，將來(lái)源于中國(guó)患者血清病毒的完整結(jié)構(gòu)基因(core-p7)和部分非結(jié)構(gòu)基因(NS2及NS3)插入復(fù)制子，成功構(gòu)建了四個(gè)不同的1b型HCV全長(zhǎng)cDNA克隆。將這些1b型HCVRNA轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞后，雖然未能成功建立感染性細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，卻能檢測(cè)到低水平的病毒RNA的復(fù)制。經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn)，我們構(gòu)建的1b-H-P2、1b-H-80和1b-G-P2、

23、1b-G-80在非結(jié)構(gòu)基因區(qū)適應(yīng)性突變的不同導(dǎo)致它們RNA復(fù)制水平有所不同，在一定程度上也說(shuō)明不同的適應(yīng)性突變位點(diǎn)之間存在協(xié)同作用。
　　 結(jié)論：
　　 本研究表明中國(guó)患者治療前HCV的氨基酸變異情況可以影響PEG-IFN/RBV治療1b亞型CHC的療效，氨基酸變異主要集中在p7，NS2和NS3蛋白。完整擴(kuò)增HCV5'端半基因組為構(gòu)建HCV全長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)打下了基礎(chǔ)，并且序列分析的結(jié)果為HCV蛋白與干擾素抵抗的體外研究實(shí)

24、驗(yàn)提供了線索。同時(shí)我們成功建立了針對(duì)我國(guó)人群易感染的HCV1b亞型體外復(fù)制子的細(xì)胞模型，不僅為本實(shí)驗(yàn)室HCV致病機(jī)制的研究及對(duì)抗病毒藥物的評(píng)價(jià)提供了一個(gè)新的途徑，也為下一步建立1b型HCV全長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)提供了一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)。
　　 在1b-H和1b-G復(fù)制子的基礎(chǔ)上，我們成功構(gòu)建了4個(gè)1b型HCV全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒，雖然未能成功建立感染性細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，卻能檢測(cè)到低水平的病毒RNA的復(fù)制。分析原因，可能是由于病毒在裝配和釋放的

25、過(guò)程中，某些環(huán)節(jié)存在未能闡明的問(wèn)題，導(dǎo)致產(chǎn)生的病毒顆粒感染活性低下;也可能是因?yàn)樗鶚?gòu)建的cDNA還存在某些缺陷，不能產(chǎn)生完整的病毒顆粒。為了排除后一種原因，我們使用已經(jīng)明確在痘病毒輔助系統(tǒng)輔助下能有效復(fù)制并產(chǎn)生感染性病毒顆粒的1bHCVcDNA為模板，重新構(gòu)建1b型HCV全長(zhǎng)cDNA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后仍然未能獲得感染性病毒顆粒。此結(jié)果表明，我們構(gòu)建的1b型全長(zhǎng)cDNA不具有感染性與基因序列缺陷無(wú)關(guān)。病毒在細(xì)胞中能否成功復(fù)制與裝配，是病毒與細(xì)胞