細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶調(diào)控細(xì)胞死亡的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：CDK1與細(xì)胞凋亡
　　 目的：探討CDK1 在細(xì)胞凋亡中的重要作用及其機(jī)制研究。
　　 材料和方法：先后構(gòu)建了表達(dá)CDK1的質(zhì)粒、突變了CDK1 主要磷酸化位點(diǎn)（包括Thr161和Tyr15）的質(zhì)粒和能有效沉默CDK1表達(dá)的RNAi，以肝癌細(xì)胞Hela 為研究對(duì)象，以紫外打擊為凋亡的主要誘導(dǎo)方式，采用MTT法、流式細(xì)胞學(xué)分析、流式細(xì)胞學(xué)分選技術(shù)、免疫熒光分析、蛋白質(zhì)免疫共沉淀

2、技術(shù)、Western blot 分析等技術(shù)分析細(xì)胞在遭受外界打擊的條件下，CDK1 蛋白與凋亡相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1）我們成功構(gòu)建了能夠表達(dá)CDK1 蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，能夠有效沉默CDK1表達(dá)的RNAi和突變了Thr161位蛋白和Tyr15位蛋白的表達(dá)CDK1 質(zhì)粒；高表達(dá)CDK1的細(xì)胞在紫外線打擊下凋亡率顯著增加；沉默CDK1表達(dá)的細(xì)胞在紫外線打擊下凋亡率顯著下降；進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞引入突變了

3、Tyr15位蛋白的CDK1 質(zhì)粒時(shí)，紫外誘導(dǎo)的G1 期特異性細(xì)胞凋亡是增加的；當(dāng)細(xì)胞引入突變了Thr161位蛋白的CDK1 質(zhì)粒時(shí)，紫外打擊導(dǎo)致的細(xì)胞的G1 期凋亡相對(duì)有所減少，免疫共沉淀顯示帶有Flag 尾Tyr15突變體其Thr161位點(diǎn)可以被磷酸化。
　　 2）在低血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞G1 期阻滯模型中，當(dāng)紫外打擊后根據(jù)不同的時(shí)間點(diǎn)我們對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了分選，與對(duì)照組相比，紫外打擊組細(xì)胞內(nèi)Phospho-cdc2 (Tyr15)的

4、表達(dá)是逐漸下降，而同時(shí)出現(xiàn)了Phospho-cdc2 (Thr161)表達(dá)的上升；對(duì)照組和紫外打擊組內(nèi)CDK2 處于低水平表達(dá),沒(méi)有出現(xiàn)顯著性改變；凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)上調(diào)。
　　 3）對(duì)細(xì)胞紫外線打擊后分別提取胞核蛋白和胞漿蛋白，結(jié)果顯示紫外打擊組胞核中Phospho-cdc2 (Tyr15)表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而胞漿中出現(xiàn)了顯著下降。
　　 4）免疫熒光分析顯示，細(xì)胞在紫外打擊后少量的Ph

5、ospho-cdc2 (Tyr15)出現(xiàn)了聚集于凋亡小體處的現(xiàn)象，Phospho-cdc2 (Thr161)濃聚在胞漿中。
　　 結(jié)論：
　　 1）CDK1表達(dá)過(guò)多可以促使凋亡的發(fā)生，抑制CDK1的表達(dá)可以減少細(xì)胞的凋亡。
　　 2）通過(guò)向細(xì)胞引入外源性表達(dá)的CDK1 相關(guān)磷酸化位點(diǎn)突變體后其Thr161 蛋白可以被磷酸化，而磷酸化的后果是促發(fā)了凋亡。而引入Thr161突變的CDK1 并沒(méi)有顯著抑制凋亡的發(fā)生。<

6、br>　　 3）從時(shí)間的觀點(diǎn)看來(lái)，CDK1 在G1 期如果出現(xiàn)了異常激活則可能直接導(dǎo)致凋亡的發(fā)生；從空間的角度理解，CDK1 Thr161 磷酸化后若異常停留在胞漿中，和（或）CDK1Tyr15 以磷酸化的方式入核或在胞漿中去磷酸化也是凋亡發(fā)生的必然條件之一。
　　 第二部分：CDK1與細(xì)胞自噬
　　 目的：
　　 探討CDK1在細(xì)胞自噬中的重要作用。
　　 材料和方法：
　　 先后構(gòu)建了高表達(dá)

7、CDK1的質(zhì)粒和能有效沉默CDK1表達(dá)的RNAi，以肝癌細(xì)胞Hela 為研究對(duì)象，通過(guò)Dhanks 液饑餓為主要誘導(dǎo)方式，采用流式細(xì)胞學(xué)分析、免疫熒光分析、電鏡和Western blot 分析等技術(shù)分析細(xì)胞在饑餓所誘導(dǎo)的自噬中，CDK1 蛋白在其中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 當(dāng)細(xì)胞導(dǎo)入高表達(dá)CDK1后，我們可以見(jiàn)到相對(duì)于對(duì)照組，其自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增加，自噬泡更多且更大；相反，當(dāng)我們沉默CDK1的表達(dá)后，細(xì)胞自噬的現(xiàn)象明