白念珠菌耐藥相關(guān)蛋白Rta2p的生物功能及分子機(jī)制研究.pdf

1、由于臨床上唑類抗真菌藥物(尤其是氟康唑)的廣泛和長期使用,導(dǎo)致了白念珠菌耐藥性產(chǎn)生,這是臨床治療白念珠菌感染失敗的首選原因。白念珠菌耐藥性的獲得是多基因在多層級水平變異積累的復(fù)雜過程；目前已明確藥物外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過度表達(dá)是白念珠菌耐藥性產(chǎn)生的重要原因,這類蛋白包括能量依賴性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Cdr1p和Cdr2p)和易化載體超家族蛋白(Mdr1p和Flu1p)。 本研究利用氟康唑和氟奮乃靜聯(lián)合長期誘導(dǎo)已知耐藥蛋白編碼基因(CDR1,

2、CDR2,CaMDR1和FLU1)缺失的白念珠菌DSY1024,得到對唑類藥物(包括氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、益康唑和活力康唑)高度耐藥的菌株DSF28;然后利用基因表達(dá)譜芯片在DSF28中篩選得到13條上調(diào)基因和22條下調(diào)基因,其中多數(shù)為未知功能基因(49％);其余基因的功能涉及RNA的轉(zhuǎn)錄和合成(14％)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路(9％)、氨基酸和碳水化合物代謝(9％)、小分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(9％)、能量生成(5％)和未分類功能基因(5％)。利

3、用實(shí)時(shí)定量RT-PCR考察了DSF28耐藥性的產(chǎn)生過程中,13條上調(diào)基因的動態(tài)表達(dá)水平；利用非監(jiān)督聚類分析對這13條基因的動態(tài)表達(dá)樣式進(jìn)行聚類,發(fā)現(xiàn)這些基因具有3類表達(dá)樣式,其中RTA2,MXR1,CPA2,ARO3和BAT22的表達(dá)樣式與已知耐藥基因ERG11,CDR1和CaMDR1在耐藥產(chǎn)生過程中的表達(dá)樣式類似,而且在耐藥性產(chǎn)生過程中均保持較高的表達(dá)水平。 本研究又利用基因敲除和異位高表達(dá)技術(shù)成功構(gòu)建了RTA2基因在白念珠野

4、生菌RM1000和已知耐藥基因缺失菌DSY1024中的缺失菌和高表達(dá)菌。利用微量液基稀釋法和Spot assay方法發(fā)現(xiàn)RTA2基因在白念珠菌RM1000和DSY1024中缺失均導(dǎo)致對唑類藥物包括氟康唑、益康唑、伊曲康唑、酮康唑和活力康唑敏感性不同程度增加；而RTA2基因在白念珠菌RM1000和DSY1024中高表達(dá)均導(dǎo)致對上述唑類藥物敏感性下降,證明RTA2基因參與白念珠菌對畔類藥物耐藥性的產(chǎn)生。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR我們發(fā)現(xiàn)26株

5、臨床分離的白念珠耐藥菌中有18株菌中RTA2基因不同程度過度表達(dá),但在18株臨床分離的敏感菌中RTA2基因高表達(dá)水平變化很??；說明RTA2基因參與白念珠菌耐藥性形成具有臨床意義。 另外,有研究報(bào)道高濃度的氯化鈣能夠誘導(dǎo)RTA2基因的表達(dá)上調(diào),而且這種上調(diào)作用依賴于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)及其轉(zhuǎn)錄因子Crzlp;而CaN通路能夠被氯化鈣激活,并參與白念珠菌耐藥性的形成,但其參與耐藥形成的靶基因目前尚不明確。

6、本研究通過加入CaCl2、鈣離子螯合劑EGTA以及CaN抑制劑(FK506和Csh)考察了唑類藥物(氟康唑和酮康唑)對白念珠菌RM1000和RTA2基因缺失菌JXM101的抗真菌活的變化,發(fā)現(xiàn)CaN通路通過其靶基因RTA2調(diào)節(jié)對唑類藥物的耐藥性,我們進(jìn)一步考察了CNA(編碼CaN催化亞單位)缺失菌、CNA回復(fù)菌、CRZ1(編碼CaN通路轉(zhuǎn)錄因子Crzlp)缺失菌和CRZ1回復(fù)菌對唑類藥物(氟康唑和酮康唑)的抗真菌活性變化,得到了與RTA

7、2基因單獨(dú)缺失一致的結(jié)果。本文又利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR在RTA2基因轉(zhuǎn)錄水平證明CaCl2能夠以CaN和Crzlp依賴的方式上調(diào)RTA2基因的表達(dá)。證明CaN通路調(diào)節(jié)自念珠菌對唑類藥物的耐藥性產(chǎn)生依賴于RTA2基因,而RTA2基因的表達(dá)水平的上調(diào)依賴于CaN通路。利用透射電鏡考察白念珠菌超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):RTA2基因缺失使得自念珠菌的細(xì)胞膜容易受到氟康唑的損傷；而氯化鈣誘導(dǎo)的RTA2基因高表達(dá)能夠減弱氟康唑?qū)?xì)胞膜的損傷作用。生物信息學(xué)分