Snapin對(duì)神經(jīng)分泌的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、細(xì)胞分泌功能通過囊泡胞吐過程來完成。囊泡胞吐過程是一個(gè)涉及許多蛋白質(zhì)、脂質(zhì)分子等物質(zhì)并有多個(gè)細(xì)胞器參與的復(fù)雜過程，由囊泡的生成、成熟、募集、拴系和錨定、囊泡的激活、最后囊泡與細(xì)胞膜融合及其內(nèi)含物通過融合孔釋放至胞外等步聚組成。SNARE蛋白核心復(fù)合體是膜融合的分子基礎(chǔ)，為膜融合提供能量。Ca2+是調(diào)節(jié)性分泌的觸發(fā)信號(hào)，synaptotagmin是囊泡膜融合過程的Ca2+感受蛋白，它與SNARE蛋白一起組成膜融合的最小分子構(gòu)件。細(xì)胞胞吐活

2、動(dòng)受到一些調(diào)節(jié)蛋白，如α-SNAP、NSF、Munc18/nSec1、Munc13、Rab蛋白及效應(yīng)物(rabphilin、Rim和Noc2等)和鈣結(jié)合蛋白(如calmodulin和CAPS)等的調(diào)控。 囊泡的“激活”是囊泡獲得(與靶膜)融合能力的過程。它是低濃度鈣(數(shù)百納摩爾)和磷脂酰肌醇代謝產(chǎn)物依賴性的耗能過程，需要ATP水解提供自由能。囊泡激活過程受到Ca2+、二酰甘油、Munc13、蛋白激酶A和蛋白激酶C、SV2A、NS

3、F以及Snapin等信號(hào)分子和蛋白質(zhì)的調(diào)控。在Ca2+依賴的調(diào)節(jié)性分泌活動(dòng)中，囊泡的激活過程是限速性步驟。激活囊泡的數(shù)目代表可釋放囊泡庫的大小?？舍尫拍遗輲斓拇笮∪Q于未激活囊泡庫的大小以及激活、去激活和消耗(即囊泡融合)的速率。囊泡激活的分子機(jī)制目前還不是十分清楚，可能是SNARE蛋白聚合形成的trans(異位)-SNARE復(fù)合體或trans(同位)-SNARE蛋白復(fù)合體與鈣離子感受蛋白synaptotagmin相互作用形成的復(fù)合物賦

4、予了囊泡與靶膜融合的能力。 Snapin是新近發(fā)現(xiàn)的與SNAP-25結(jié)合的小分子(15kD)蛋白，為普遍表達(dá)的胞漿蛋白。Snapin與SNAP-25結(jié)合并促進(jìn)syanaptotagmin與SNARE復(fù)合體的結(jié)合。Snapin通過超螺旋與SNAP-25、SNAP-23和非神經(jīng)元性的SNAP-25同功型結(jié)合。也可能與RGS7、腺苷酸環(huán)化酶Ⅵ、EBAG9產(chǎn)物和受體酪氨酸激酶MET相互作用。在背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，Snapin和synapto

5、tagminⅨ均與vanilloid受體-1(vanilloidreceptor-1,TRPV1)發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)PKA介導(dǎo)的TRPV1通道向細(xì)胞膜的募集過程，其調(diào)節(jié)作用可能通過調(diào)節(jié)SNARE蛋白復(fù)合體依賴的胞吐過程來實(shí)現(xiàn)。Snapin也是溶酶體相關(guān)細(xì)胞器生物發(fā)生蛋白復(fù)合物(BiogenesisofLysosome-relatedOrganellesComlex-1,BLOC-1)的亞單位，因而也可能參與對(duì)細(xì)胞胞吞活動(dòng)的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)采用

6、同源重組方法產(chǎn)生失效突變，使snapin基因不表達(dá)－即snapin基因敲除，采用生物化學(xué)方法研究Snapin蛋白的缺失對(duì)與分泌相關(guān)的必需蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)水平、SNARE蛋白的聚合反應(yīng)和synaptotagmin與SNARE復(fù)合體相互作用的影響。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Snapin缺失不影響已知參與突觸囊泡胞吐活動(dòng)的必需蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，表明snapin基因敲除不會(huì)引起為神經(jīng)元軸突末梢遞質(zhì)釋放所必須的蛋白質(zhì)的代償性表達(dá)變化。此外，

7、Snapin缺失也不影響SNARE蛋白的聚合反應(yīng)。與野生型同胎小鼠相比較，基因敲除小鼠腦勻漿中的synaptotagmin-1與SNAP-25的結(jié)合顯著降低(34±3﹪,from11littermates,p<0.01)。 實(shí)驗(yàn)使用高時(shí)間分辨率的膜電容測(cè)量法測(cè)量囊泡與細(xì)胞膜的融合并同時(shí)使用微碳纖電化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)兒茶酚胺的釋放，研究Snapin對(duì)嗜鉻細(xì)胞分泌動(dòng)力學(xué)和鈣離子依賴性的影響；用高強(qiáng)度的短暫紫外光來裂解NP-EGTA使細(xì)胞

8、胞漿的游離鈣離子濃度瞬時(shí)升高到某一較高濃度并維持一段時(shí)間，快速刺激細(xì)胞分泌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明snapin基因敲除小鼠嗜鉻細(xì)胞胞吐簇發(fā)相的幅度顯著減少而持續(xù)相沒有變化，野生型Snapin在基因敲除細(xì)胞中的過表達(dá)可以完全消除snapin基因的敲除對(duì)胞吐的抑制作用，使胞吐簇發(fā)相恢復(fù)到野生型細(xì)胞的水平。電子顯微鏡觀察和分析顯示snapin基因敲除對(duì)嗜鉻細(xì)胞囊泡的數(shù)目和空間分布沒有影響，即囊泡的錨定不受影響。Ramp實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Snapin的缺失不改

9、變囊泡胞吐的鈣離子敏感性和協(xié)同作用，即胞吐的鈣依賴性沒有改變。因此，snapin基因敲除小鼠的生物化學(xué)和電生理研究表明：Snapin參與對(duì)囊泡胞吐活動(dòng)的調(diào)節(jié)，其分子機(jī)制可能是促進(jìn)synaptotagmin與SNARE復(fù)合體的相互作用，穩(wěn)定synaptotagmin-SNARE復(fù)合物，降低激活過程的逆反應(yīng)(去激活)速率，從而穩(wěn)定激活囊泡，維持可釋放囊泡庫的正常大小。 簡要地介紹了細(xì)胞分泌研究領(lǐng)域常用的幾種先進(jìn)生物物理技術(shù)和手段；描