豬偽狂犬病病毒(HNX株)的生物學(xué)特性與比較基因組學(xué)研究.pdf

1、豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起，發(fā)病動物主要表現(xiàn)體溫升高、瘙癢、急性腦脊髓炎和繁殖障礙等主要臨床癥狀。該病危害各階段的豬，給世界多國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。美國和部分歐盟國家通過實(shí)施根除計(jì)劃，凈化了家豬的PR。在我國，隨著PRV弱毒疫苗的使用，以及部分規(guī)?；N豬場實(shí)施PR的根除凈化計(jì)劃，PR得到有效的控制。但是自2011年10月以來，我國有超過20個(gè)省市

2、區(qū)規(guī)模化豬場暴發(fā)了PR，許多免疫過PRV弱毒疫苗的豬場也有發(fā)病報(bào)道，這給我國PR的防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。為了深入了解此次PR重新暴發(fā)的原因，開展了以下研究工作:
　　1.PRV的病原流行病學(xué)調(diào)查
　　2012年1-11月，從我國多省市386家規(guī)?；i場送檢的1227份臨床組織樣品中檢測出13.73％(53/386)的豬場存在著PRV野毒感染，12.47％(153/1227)的樣品中存在著PRV野毒;其中4月，5月，11月送檢

3、的樣品中PRV野毒的感染率都超過30.00％。
　　選取8份PRV野毒感染的陽性樣品，對其gB、gC、gE、TK、RR1、RR2等毒力和免疫原性相關(guān)基因分別進(jìn)行測序、比對和進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，野毒株與Bartha株相比，gB、gC和RR1基因都存在氨基酸的缺失或插入突變，各基因同源性都比Ea株這些基因同源性低，各基因都不在同一進(jìn)化分支。結(jié)果表明PRV野毒株與Ea株親緣關(guān)系比Bartha株近。
　　2.PRV的分離鑒定

4、>　　PRV野毒感染樣品分別通過病毒的分離鑒定，測定其TCID50、一步生長曲線和病毒粒子的形態(tài)觀察等研究，分離鑒定出PRV HNX、HNB、HNQZ、HNQX、HNZK株等5株病毒，其第1-9代病毒的TCID50為10-5.0-10-6.5/0.1 mL，HNX株與Fa株生長趨勢相似，病毒形態(tài)均為直徑150nm左右，橢球形，有囊膜和纖突的粒子。
　　3.PRV對小鼠的致病力研究
　　PRV HNX、HNB、Ea、Fa株對6

5、周齡Balb/c小鼠的LD50分別為102.0TCID50、102.4TCID50，102.0TCID50、100.7TCID50;同劑量感染小鼠，HNX株和HNB株感染的小鼠在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重瘙癢等臨床癥狀，能引起小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞增多，神經(jīng)元變性壞死等嚴(yán)重的病理損傷。
　　4.HNX株對PRV Bartha株母源抗體仔豬的致病力研究
　　HNX株和Ea株分別頸部肌肉注射含有Bartha株母源抗體的仔豬，結(jié)果顯示，接種H

6、NX株的仔豬，出現(xiàn)體溫升高，瘙癢等臨床癥狀，其鼻拭子和肛拭子中持續(xù)排毒21d，第28d大腦、肺、扁桃體、脾、肝和腎等組織中都檢測出低拷貝數(shù)的PRVDNA。而接種Ea株的仔豬，無明顯臨床癥狀，其鼻拭子和肛拭子中短暫排毒，第28d大腦、肺和扁桃體等組織中檢測出低拷貝數(shù)的PRV DNA。結(jié)果表明，HNX株對PRV Bartha株母源抗體的仔豬有很強(qiáng)的致病力，母源抗體不能保護(hù)仔豬抵御PRVHNX株感染，也不能阻止其排毒。
　　5.HNX株

7、對Bartha株疫苗免疫仔豬的致病力研究
　　免疫Bartha株弱毒疫苗28d的仔豬和未免疫疫苗的PRV抗體陰性仔豬分別都滴鼻感染和頸部肌肉注射107TCID50的HNX株，結(jié)果顯示，所有仔豬感染HNX株后，都出現(xiàn)體溫升高、食欲不振、打噴嚏、呼吸困難、精神沉郁等臨床癥狀，其鼻拭子和肛拭子中持續(xù)排毒，第16d大腦、肺、扁桃體、脾和肝等組織中都有高拷貝數(shù)的PRV DNA，感染仔豬的大腦、扁桃體、肺、脾和腎等組織中都有嚴(yán)重的病變和病理損

8、傷，免疫組化都出現(xiàn)陽性信號，其中扁桃體和肺組織中陽性信號最強(qiáng);未免疫疫苗的陰性仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，50％的仔豬死亡。結(jié)果表明，PRVHNX株對抗體陰性仔豬和疫苗免疫的仔豬都有很強(qiáng)的致病力，Bartha株弱毒疫苗免疫，不能保護(hù)仔豬抵御HNX株的感染，不能阻止仔豬排毒，也不能阻止PRV HNX株在大腦、扁桃體、肺、脾和腎等組織中定植。
　　6.HNX、HNB、Fa和Ea株全基因組測序研究
　　利用第二代高通量測序技術(shù)和Sanger

9、法分別對HNX、HNB、Fa株和Ea株進(jìn)行全基因組測序，其核苷酸序列數(shù)分別為142294bp、142255bp、141930bp和142334bp，GC含量分別為73.56％、73.61％、73.67％和73.60％，GenBank登錄號分別為KM189912、KM189914、KM189913和KU315430，都編碼70個(gè)基因，均包含獨(dú)特長序列區(qū)(UL)，內(nèi)部重復(fù)序列（IRS），獨(dú)特短序列區(qū)(US)和末端重復(fù)序列(TRS)等4部分。

10、
　　7.PRV不同毒株比較基因組學(xué)研究
　　對PRV HNX、HNB、Fa、Ea株與Bartha株等PRV毒株的全基因組和各基因序列比對分析，結(jié)果顯示，HNX株與HNB、Ea、Fa和Bartha株的同源性分別為98.1％、96.7％、96.4％和90.1％，Ea和Fa株與Bartha株的全基因組序列同源性分別為90.3％和90.7％，HNX、HNB、Ea、Fa株與Bartha株的所有基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為91.

11、1％-99.9％和82.3％-99.7％; HNX、HNB、Fa、Ea株與國外分離株全基因組比對，其UL36基因、US1基因和非編碼區(qū)序列同源性較低，HNX和HNB株與Fa株各基因氨基酸比對，有26個(gè)基因出現(xiàn)了差異，其中UL49.5，UL36和US1基因氨基酸差異率最大;PRV全基因組進(jìn)化樹存在兩個(gè)獨(dú)立分支:中國分離株分支與國外分離株分支，中國分離株分支位于不同亞分支，中國新分離株與中國2012年前分離株的免疫原性基因分別位于兩個(gè)亞分支

12、，而毒力相關(guān)基因位于同一個(gè)亞分支。結(jié)果表明，中國分離株之間全基因組同源性比Bartha、Becker、Kaplan株高，親緣關(guān)系較近，中國新分離株與2012年前中國分離株基因組免疫原性基因進(jìn)化出不同的亞分支，而毒力相關(guān)基因進(jìn)化關(guān)系未分化。
　　8.PRV全基因組和部分基因序列重組分析研究
　　對PRV HNX、HNB、Fa、Ea株和Bartha、Kaplan、Becker、TJ、ZJ01、HeN1、JS-2012等株全基因組