豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的真核表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、ORF2基因編碼的蛋白是豬圓環(huán)病毒2型的主要結(jié)構(gòu)蛋白，此蛋白具有較好的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)從重組質(zhì)粒pMD18-T-ORF2切下ORF2基因片段，克隆到載體pEGFP-C1上，再切掉移碼的堿基，補(bǔ)平，自身連接轉(zhuǎn)入DH5a中。經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定ORF2基因片段正確的克隆到pEGFP-C1載體上。將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-ORF2轉(zhuǎn)染到IBRS-2細(xì)胞中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，表達(dá)的蛋白約為59KD。經(jīng)Western-blot檢測(cè)，能夠

2、被PCV-2陽性血清所識(shí)別，具有良好的抗原性?！　±帽磉_(dá)的融合蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)PCV-2抗體的間接ELISA方法，并對(duì)ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索，確定了抗原的最適包被濃度為3.6ug/ml，最適血清稀釋度為1：40，以酶標(biāo)SPA作為二抗，最適工作濃度為1：80。包被的融合蛋白不與豬瘟、豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，重復(fù)性好，與IDEXX試劑盒相比，特異性為96％，敏感性為90％，兩