Bt轉(zhuǎn)基因結(jié)球甘藍(lán)的遺傳分析和檢測(cè).pdf

1、結(jié)球甘藍(lán)(Brassica olerecea var. capitata)是中國(guó)的一種重要蔬菜,栽培面積已達(dá)幾十萬公頃.生產(chǎn)上結(jié)球甘藍(lán)蟲害發(fā)生相當(dāng)嚴(yán)重,造成了產(chǎn)量和品質(zhì)的損失.為害結(jié)球甘藍(lán)的主要害蟲和鱗翅目的昆蟲,其中主要包括菜粉蝶和小菜蛾等.由于在已有的種質(zhì)資源中很難找到可用的抗蟲材料這使得蔬菜常規(guī)抗蟲育種受到了限制.利用基因工程技術(shù)手段培育抗蟲蔬菜新品種是農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要方向.基因工程技術(shù)不僅安全有效而且投資少、見效快、特異性殺滅

2、害蟲和污染環(huán)境.植物基因工程為抗性育種提供了一種有效的方法.人們已從細(xì)菌中分離得到蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白基因(Bt).其蛋白產(chǎn)物對(duì)鱗翅目昆蟲具有特異的毒殺作用而對(duì)高等動(dòng)物和人無害.因此,將Bt基因轉(zhuǎn)入結(jié)球甘藍(lán)而獲得抗蟲材料而成為可能.該研究?jī)?nèi)容主要涉及轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因甘藍(lán),對(duì)已獲得的卡那霉素抗性植株的分子檢測(cè),轉(zhuǎn)化植株的抗蟲鑒定,同時(shí)對(duì)外源基因在轉(zhuǎn)化植株自交后代的遺傳分離情況進(jìn)行了研究.取得的

3、主要研究結(jié)果如下:1.10mg/L-15mg/L的卡那霉素(Kanamycin, Km)可以有效抑制"牛心"甘藍(lán)下胚軸綠芽的再生,使其不能分化出芽或分化出白色或紫色芽.2.頭孢霉素(Cefotaxime, Cef)對(duì)"牛心"甘藍(lán)下胚軸綠芽的誘導(dǎo)有較強(qiáng)的抑制作用.隨著頭孢霉素濃度的增加,抑制作用加劇.3.共培養(yǎng)時(shí)間影響結(jié)球甘藍(lán)轉(zhuǎn)化頻率,該實(shí)驗(yàn)中共培養(yǎng)48h得到的抗性芽較多.4.轉(zhuǎn)化獲得"牛心"結(jié)球甘藍(lán)植株.經(jīng)PCR檢測(cè),證明Bt基因已經(jīng)整

4、合到結(jié)球甘藍(lán)基因組中.5.提取部分T<,0>代"中甘八號(hào)"PCR陽性植株的基因組DNA,經(jīng)Southern雜交分析,證明Bt基因已經(jīng)整合到結(jié)球甘藍(lán)基因組中.6、"中甘八號(hào)"中經(jīng)Southern雜交檢測(cè)的陽性植株,在蕾期進(jìn)行自交,收獲T<,1>代種子.對(duì)T<,1>世代植株進(jìn)行苗期卡那霉素涂抹葉片和PCR擴(kuò)增分析鑒定,發(fā)現(xiàn)Bt基因和NPTII基因在植株體內(nèi)遺傳符合顯性單基因孟德爾遺傳規(guī)律.7.分別對(duì)"中甘八號(hào)"轉(zhuǎn)化的T<,0>、T<,1>代