利用Cre-lox重組系統(tǒng)篩選友好基因座.pdf

1、該實驗擬利用Cre/lox系統(tǒng)來篩選出友好基因座,即在動物細胞染色體上找到一個可以高效表達外源基因的"友好座位",以使外源基因在導入動物體后能夠高效表達的整個實驗技術過程更有效、更容易.合成loxP和lox511位點,將其同方向地克隆到載體pEGFP-1的多克隆位點之內(nèi),構建成含有l(wèi)ox位點的通用載體——plox,然后將報告基因GFP及neo基因片段克隆到載體plox上的loxP和lox511序列之間,構建成一基因打靶載體-ploxGF

2、P.將雞γ-干擾素cDNA克隆到載體plox上的loxP和lox511序列之間,構建成另一打靶載體-ploxIFN.首先將質(zhì)粒ploxGFP DNA電轉染牛胎兒成纖維細胞,并用G418篩選,篩選出綠色熒光細胞克隆,增殖培養(yǎng)之后,將質(zhì)粒ploxIFN和pBS185 DNA共轉染熒光細胞克隆,篩選出不發(fā)光的克隆.用PCR法檢測兩個不發(fā)光細胞克隆、發(fā)光細胞克隆及共轉染后培養(yǎng)一周的細胞,并用質(zhì)粒ploxIFN、質(zhì)粒ploxGFP及?；蚪M作為對

3、照.引物設計的位置是在loxP和lox511之外的載體序列,整個載體序列都隨轉染而進入細胞.經(jīng)PCR檢測后,有一個不發(fā)光細胞克隆擴增出了與對照質(zhì)粒ploxIFN相同的約1000bp的條帶,表明發(fā)生了替換反應;另一個不發(fā)光細胞克隆認為是在Cre重組酶的作用下其內(nèi)部自行發(fā)生了剪切作用,剪切了GFP基因,從而只擴增出了載體序列和一個lox位點的約500bp的條帶.以綠色熒光細胞克隆為模板擴增出了包括GFP基因、neo基因等在內(nèi)的約4kb的條帶