家蠶新突變體紫色類鶉斑q-lp的定位分析.pdf

1、表皮是家蠶最重要的器官之一，幼蟲期隨著每次入眠而更換，對蠶體具有保護(hù)作用。斑紋是表皮的重要特征，其形態(tài)、色彩、濃淡等性狀極富多樣性，斑紋的研究對于色素代謝及斑紋形成機(jī)理的研究具有重要的理論意義。
　　家蠶紫色類鶉斑突變體(q-lp)是在家蠶飼養(yǎng)過程中，從素蠶品種932VR中發(fā)現(xiàn)的一種新的突變體，該突變體整體斑紋與鶉斑(q)極其相似，體色為淺粉紫色，幼蟲雖然能正常發(fā)育，但是食桑量少，發(fā)育緩慢，體質(zhì)較弱，體型較小，繭型偏小。
　

2、　遺傳分析表明，該突變性狀是由一個隱性基因q-lp控制的，經(jīng)過形態(tài)標(biāo)記檢測和SSR標(biāo)記多態(tài)性分析，該基因位于家蠶第8連鎖群。在此基礎(chǔ)上利用圖位克隆技術(shù)對突變基因進(jìn)行精細(xì)定位，從基因測序和表達(dá)兩個方面對定位區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行篩選，以期找到引起突變性狀發(fā)生的突變基因，分析該基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)，為后期研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下：
　　1、在第8連鎖群篩選SSR多態(tài)性分子標(biāo)記，對q-lp進(jìn)行精細(xì)定位，最終將q-lp定位到分子標(biāo)

3、記nscaf2828-109和nscaf2828-063之間，兩標(biāo)記之間相距0.98 cM，物理距離為257kb，根據(jù)silk DB數(shù)據(jù)庫，范圍內(nèi)有14個預(yù)測基因。
　　2、以野生型和突變型4齡眠蠶表皮為材料進(jìn)行半定量分析，14個預(yù)測基因均無明顯差異，進(jìn)一步以蟻蠶為材料進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)突變體中BGIBMGA005421-TA和 BGIBMGA005422-TA表達(dá)量較野生型略微偏低。BGIBMGA005421-TA和BGIBM

4、GA005422-TA在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫Silk DB和KAIKObase中有著不同的注釋，Silk DB中標(biāo)注BGIBMGA005421-TA和BGIBMGA005422-TA兩個基因，而在 KAIKObase數(shù)據(jù)庫中，只標(biāo)注一個基因，該基因的功能注釋為Orcokinin基因（簡寫Ork）。Ork基因包括BGIBMGA005421-TA基因5’ UTR和第1、2個外顯子的序列以及BGIBMGA005422-TA基因第1個外顯子3’端部

5、分序列和第2、3、4個外顯子的全部序列。基因克隆實驗證明了BGIBMGA005421-TA、BGIBMGA005422-TA及Ork的轉(zhuǎn)錄本同時存在。
　　對這3個基因的ORF和基因組進(jìn)行克隆測序，BGIBMGA005422-TA基因在突變體和野生型之間不存在序列差異；而 BGIBMGA005421-TA基因在突變型中第2個外顯子上缺失了一個單堿基C；Ork第2個外顯子與BGIBMGA005421-TA基因相同位點存在單堿基缺失突

6、變。
　　3、野生型BGIBMGA005421-TA基因cDNA全長為1099bp，其中5’UTR67 bp，ORF864bp，3’ UTR168 bp，Poly A28 bp。在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫Silk DB進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)其5’ UTR部分序列與第1個外顯子相距6kb左右；在轉(zhuǎn)錄起始位點上游20-30 bp的位置發(fā)現(xiàn)該基因的啟動子核心元件TATABox。通過Q-PCR對BGIBMGA005421-TA基因進(jìn)行組織表達(dá)譜和各

7、發(fā)育時期表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)其在脂肪體中表達(dá)量最高，在表皮、中腸和氣管中表達(dá)量也較高；在幼蟲期各齡期中盛食期相比其他時期表達(dá)量偏高，大蠶期相比小蠶期表達(dá)量偏高，將熟蠶表達(dá)量達(dá)到最大。
　　4、單堿基缺失導(dǎo)致BGIBMGA005421-TA和Ork基因翻譯提前終止，可能是突變體產(chǎn)生的主要原因。在野生型家蠶的二齡將眠蠶中進(jìn)行BGIBMGA005421-TA基因的RNAi實驗，發(fā)現(xiàn)該基因的沉默可增加家蠶皮膚黑斑，初步說明該基因與紫色類鶉斑表