hfad-3轉(zhuǎn)基因小鼠來源的胚胎干細(xì)胞生物學(xué)分析.pdf

1、多不飽和脂肪酸去飽和酶基因(fad-3）編碼的ω-3去飽和酶FAD3是定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的一種膜整合蛋白，能夠?qū)ⅵ?6多不飽和脂肪酸(PUFAs)轉(zhuǎn)化為ω-3 PUFAs。本實(shí)驗(yàn)室從亞麻(Linum usitatissimumL.)中克隆出fad-3基因，對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行人源化處理，得到優(yōu)化的fad-3基因，并記為hfad-3;通過顯微注射法，獲得了hfad-3轉(zhuǎn)基因小鼠。本研究從hfad-3轉(zhuǎn)基因小鼠的囊胚中分離出了5株轉(zhuǎn)基因小鼠胚

2、胎干細(xì)胞系，命名為Fad3-ESL1、2、3、4、5。通過免疫組化、qPCR和流式細(xì)胞分析等方法對(duì)所獲得的胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行深入分析，揭示攜帶hfad-3的胚胎干細(xì)胞與非轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞可能存在的生物學(xué)差異。
　　結(jié)果:(1) Fad3-ES在體外培養(yǎng)條件下，能夠長期保持未分化狀態(tài)，邊緣折光性好，呈典型的鳥巢狀干細(xì)胞形態(tài);堿性磷酸酶、SOX-2、OCT-4、NANOG和SSEA-1等干細(xì)胞標(biāo)志性因子均呈陽性;在體外能夠

3、分化形成類胚體，體內(nèi)可以形成具有內(nèi)、中、外三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤。(2)經(jīng)檢測(cè)，外源基因hfad-3能夠穩(wěn)定整合于胚胎干細(xì)胞的基因組中，并且證實(shí)在傳代30代后，hfad-3仍然穩(wěn)定整合于細(xì)胞基因組中。而且，實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)顯示，hfad-3基因能夠在mRNA水平有效表達(dá)。(3)細(xì)胞生長曲線和倍增時(shí)間分析表明，F(xiàn)ad3-ES的細(xì)胞在接種后能夠快速增殖，72h后到達(dá)平臺(tái)期。與同代次的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?xì)胞相比，細(xì)胞生長較慢。細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果也表明

4、，轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞系的細(xì)胞周期比對(duì)照組相對(duì)滯后。(4)凋亡檢測(cè)的結(jié)果顯示，F(xiàn)ad3-ES的早期凋亡、凋亡和死亡細(xì)胞的比例都顯著低于對(duì)照組，而且不同代次之間，隨著代次增加，凋亡和死亡細(xì)胞比例升高，呈代次依賴規(guī)律，符合細(xì)胞的生長規(guī)律。(5)為了解干細(xì)胞中FAD3的功能情況，我們對(duì)不同代次的干細(xì)胞的脂肪酸表達(dá)做了分析，F(xiàn)ad3-ES細(xì)胞的ω-6/ω-3比率顯著低于對(duì)照組;細(xì)胞培養(yǎng)液中的脂肪酸分析結(jié)果與細(xì)胞的脂肪酸的結(jié)果具有一致性，多不飽和脂肪酸ω

5、-6/ω-3的比值都明顯降低。(6)在mRNA水平檢測(cè)與脂肪酸代謝相關(guān)的基因表達(dá)情況，LPL，F(xiàn)ABP4，PPARγ，Pnpla2，Slc27a3，Cebpa的表達(dá)都發(fā)生了明顯變化。
　　綜上所述，分離自fad-3轉(zhuǎn)基因小鼠的ES細(xì)胞具有與非轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎干細(xì)胞相似的分離培養(yǎng)能力、干細(xì)胞特征、傳代能力和分化能力;更為重要的是，F(xiàn)ad-3-ES細(xì)胞具有比對(duì)照組更強(qiáng)的抗細(xì)胞凋亡能力。外源基因fad-3在不同代次的干細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，實(shí)