禽類(lèi)Piwil1基因與piRNAa生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、Piwi(P-element induced wimpy testis)基因參與生殖干細(xì)胞自我更新、減數(shù)分裂、RNA沉默以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。在模式生物上，研究發(fā)現(xiàn)piRNAs(Piwi-interacting RNAs)介導(dǎo)PIWI蛋白的表觀遺傳調(diào)控和轉(zhuǎn)錄初水平調(diào)控過(guò)程是生殖干細(xì)胞維持、配子形成以及受精的關(guān)鍵因素，但有關(guān)家禽Piwi基因的研究報(bào)道甚少。PIWI蛋白雖然廣泛存在于各種動(dòng)物中，但大部分只局限在配子發(fā)生和胚胎發(fā)育早期表達(dá)，而且表

2、達(dá)模式也不一致，影響了其對(duì)生殖過(guò)程的具體作用機(jī)制的探討。就此而言，禽類(lèi)配子、胚胎易于獲取且便于人工操作，具有其他生物無(wú)可比擬的優(yōu)越性，可為探討PIWI蛋白如何發(fā)揮調(diào)控作用的具體機(jī)制提供研究平臺(tái)。另外，作為人類(lèi)主要的動(dòng)物蛋白來(lái)源食品，家禽業(yè)生產(chǎn)正處于發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，仍有不少問(wèn)題亟待解決:一是繁殖力持續(xù)下降，商業(yè)品種中每年有5～12％的無(wú)精癥雞遭淘汰;二是如禽流感、白血病等一些RNA病毒，因其容易變異造成預(yù)防、治療失敗，給家禽產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大

3、的損失。本研究以中國(guó)地方雞種——狼山雞為研究對(duì)象，分別從基因克隆、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和功能抑制等4個(gè)方面對(duì)Piwi like1(Piwil1)基因進(jìn)行了較為全面系統(tǒng)的研究;并以日本鵪鶉為參照群體，分析了鵪鶉Piwil1基因和PIWI蛋白特異性結(jié)合piRNAs的表達(dá)譜，為探明Piwi基因在禽類(lèi)中的生物學(xué)功能和家禽繁殖力的提高積累基礎(chǔ)資料，也為解析生殖細(xì)胞發(fā)生機(jī)制和發(fā)展新型RNA治療方法提供新的理論依據(jù)。
　　本研究首先參考GenBa

4、nk上紅色原雞Piwil1基因的mRNA序列，利用RT-PCR和RACE技術(shù)從12周齡狼山雞睪丸組織中成功克隆了Piwil1基因的全長(zhǎng)cDNA序列，包括一個(gè)2604bp的ORF，161bp的5'UTR和660bp的3'UTR。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該ORF編碼867個(gè)氨基酸殘基，含有PAZ和PIWI兩個(gè)Ago家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。啟動(dòng)子區(qū)的序列特征分析結(jié)果表明，Piwil1基因的5'調(diào)控區(qū)存在著一個(gè)長(zhǎng)489bp的CpG島，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

5、上游-25～-30bp區(qū)域沒(méi)有真核基因啟動(dòng)子區(qū)典型的DNA序列元件TATA box。
　　為了揭示雞Piwil1基因的組織、細(xì)胞表達(dá)模式，本研究利用Real-Time qPCR技術(shù)分別檢測(cè)了12周齡狼山雞不同組織（睪丸、大腦、下丘腦、腎臟、腎上腺、甲狀腺和卵巢）和不同類(lèi)型生殖系細(xì)胞（PGCs、SSCs、精原/母細(xì)胞和成熟精子）中Piwil1基因的mRNA表達(dá)量。結(jié)果表明，Piwil1基因在睪丸組織的表達(dá)量顯著高于卵巢、腎臟等其他組

6、織;在睪丸精原和精母細(xì)胞以及成熟精子中的表達(dá)量顯著高于PGCs和SSCs細(xì)胞。Piwil1基因在成熟精子的高表達(dá)，推測(cè)Piwil1基因可能在精子授精過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　為了探索Piwil1基因在雞精子形成過(guò)程中的重要作用，本研究利用Real-Time qPCR技術(shù)檢測(cè)了狼山雞5個(gè)發(fā)育階段（0、5、10、12、27周齡）6個(gè)組織（睪丸、大腦、下丘腦、腎臟、腎上腺和甲狀腺）中Piwil1基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，隨著周齡的增加，睪丸

7、中Piwil1基因的表達(dá)量不斷增加，而其他組織中Piwil1基因的表達(dá)量基本不變。在睪丸組織中，10周齡之前，Piwil1基因的表達(dá)量變化不大;10周齡之后，Piwil1基因的表達(dá)量急劇上升;27周齡時(shí)，Piwil1基因的表達(dá)量是0周齡時(shí)的35～40倍。性成熟后，Piwil1基因在睪丸組織中的表達(dá)量急劇增加，而且主要在精原（母）細(xì)胞和成熟精子中表達(dá)，推測(cè)Piwil1基因的高豐度表達(dá)應(yīng)該是維持雞精子發(fā)生所必須的。此外，本研究還檢測(cè)了Piw

8、il1基因在狼山雞上述5個(gè)發(fā)育階段卵巢組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，隨著周齡的不斷增加，Piwil1基因在卵巢組織中的表達(dá)量逐漸降低。
　　為了探索Piwil1基因在雞胚性腺發(fā)育過(guò)程的重要作用，本研究利用Real-Time qPCR技術(shù)檢測(cè)了胚胎期雌雄雞胚性腺中Piwil1基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在雄性睪丸組織中，Piwil1基因的表達(dá)呈雙峰分布，峰值分別位于第14.5天和第17.5～18.5天，推測(cè)此時(shí)Piwil1基因的高表達(dá)可

9、能與“DNA re-methylation”過(guò)程以及精原干細(xì)胞的自我更新有關(guān)。在雌性卵巢組織中，Piwil1基因的表達(dá)呈單峰分布，峰值位于第16.5～17.5天，此時(shí)初級(jí)卵母細(xì)胞已進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ前期，推測(cè)Piwil1基因可能在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂Ⅰ過(guò)程發(fā)揮重要作用。
　　前期研究表明，Piwi基因主要在生殖系細(xì)胞中表達(dá)，具有生殖系特異性。通過(guò)前面的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雞Piwil1基因mRNA在不同組織和細(xì)胞中差異表達(dá)。為了探索雞Piwil

10、1基因選擇性表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，本研究首先從基因組DNA水平通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)系列缺失法來(lái)尋找Piwil1基因的核心啟動(dòng)子區(qū)。本研究將啟動(dòng)子區(qū)的系列缺失片斷連接至熒光素酶報(bào)告基因5'端上游，成功構(gòu)建了7個(gè)含有雞Piwil1基因啟動(dòng)子區(qū)序列的螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體。然后，分別將這7個(gè)重組載體與海腎熒光素酶報(bào)告基因載體（內(nèi)參質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染GC-1細(xì)胞（生殖系細(xì)胞）和COS-7細(xì)胞（非生殖系細(xì)胞），熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果均表明Piwil1基因5'側(cè)翼區(qū)

11、-90～-43區(qū)域具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。
　　真核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要依賴(lài)于順式作用元件和反式作用因子之間的相互作用。前面的結(jié)果已表明，Piwil1基因沒(méi)有真核基因啟動(dòng)子區(qū)典型的順式作用元件TATA box。為了尋找核心啟動(dòng)子區(qū)域的重要轉(zhuǎn)錄元件，本研究利用TFSEARCH軟件對(duì)Piwil1基因5'側(cè)翼區(qū)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，-90～-16區(qū)域含有CCAAT box（-56～-52，轉(zhuǎn)錄因子NF-Y的結(jié)合位點(diǎn)）和TCCC box

12、（-34～-31，轉(zhuǎn)錄因子Ik-2的結(jié)合位點(diǎn)）兩個(gè)轉(zhuǎn)錄元件。為了探討這些轉(zhuǎn)錄元件的生物學(xué)功能，本研究利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了3個(gè)突變體，分別為CCAATbox單突變、TCCC box單突變和二者的雙突變。隨后，分別將這3個(gè)突變載體與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GC-1和COS-7細(xì)胞，熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，與野生型相比，突變體的啟動(dòng)子活性均發(fā)生了降低，這進(jìn)一步表明CCAAT box和TCCC box可能對(duì)Piwil1基因啟動(dòng)子活性具有重要作用。

13、r>　　前面的研究結(jié)果已表明，雞Piwil1基因在成年雞睪丸組織中高表達(dá)。但是，與哺乳動(dòng)物相比，獲取雞睪丸組織曲精細(xì)管生精上皮中各級(jí)生精細(xì)胞的方法還不成熟。鑒于PGCs細(xì)胞是生殖祖細(xì)胞，雞PGCs中表達(dá)Piwil1基因以及PGCs體外獲得和培養(yǎng)相對(duì)成熟等優(yōu)勢(shì)特性，本研究選擇PGCs作為Piwil1基因功能研究的細(xì)胞模型。為了研究雞Piwil1基因在生殖系中的功能，本研究首先選擇基于DNA載體的RNAi技術(shù)——shRNA干擾表達(dá)載體來(lái)抑制

14、雞PGCs細(xì)胞中Piwil1基因的表達(dá)。結(jié)果表明，不同的siRNA靶序列具有不一樣的Piwil1基因沉默效果，Piwil1基因的mRNA表達(dá)量相應(yīng)地下降了9～36％。隨后，本研究檢測(cè)了在最佳干擾效果下CR1-B和CR1-F轉(zhuǎn)座子的mRNA表達(dá)量變化。與對(duì)照組相比，雞CR1-F轉(zhuǎn)座子ORF1 mRNA的表達(dá)量升高，這從一定程度上表明Piwil1基因具有抑制轉(zhuǎn)座子活性的功能。
　　為了提高siRNA在體內(nèi)的傳遞效率，本研究選擇基于慢病

15、毒載體的RNAi技術(shù)來(lái)抑制雞PGCs細(xì)胞中Piwil1基因的表達(dá)。首先，本研究通過(guò)分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建雞Piwil1基因過(guò)表達(dá)載體作為篩選miRNA干擾表達(dá)載體的靶質(zhì)粒。細(xì)胞定位結(jié)果表明，該P(yáng)iwil1基因過(guò)表達(dá)載體能夠成功表達(dá)一種細(xì)胞質(zhì)蛋白。其次，本研究將miRNA干擾表達(dá)載體和Piwil1基因過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用Real-Time qPCR技術(shù)篩選出具有最佳干擾效果的miRNA干擾表達(dá)載體。接著，本研究將該miRN

16、A干擾表達(dá)載體通過(guò)Gateway技術(shù)亞克隆至目的載體中成功構(gòu)建了Piwil1基因-miRNA慢病毒表達(dá)載體。最后，本研究將miRNA慢病毒表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞生產(chǎn)慢病毒顆粒。慢病毒液滴度為1×108TU/ml。細(xì)胞侵染結(jié)果表明，該慢病毒液能夠成功抑制Piwil1基因的表達(dá)。
　　為了檢測(cè)Piwi基因在物種內(nèi)的序列保守性，本研究以日本鵪鶉為參照群體，再次利用RT-PCR和RACE技術(shù)從成年鵪鶉睪丸組織中成功克隆了P

17、iwil1基因的全長(zhǎng)cDNA序列，包括一個(gè)2595bp的ORF，142bp的5'UTR和667bp的3'UTR。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該ORF編碼864個(gè)氨基酸殘基，含有PAZ和PIWI兩個(gè)Ago家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。與雞Piwil1基因編碼蛋白相比，N端缺失3個(gè)氨基酸殘基。在成年鵪鶉中，PIWIL1蛋白在睪丸組織中特異性表達(dá)，表明PIWIL1蛋白在雞和鵪鶉之間具有保守的功能。
　　為了進(jìn)一步探索禽類(lèi)PIWI蛋白在精子發(fā)生和轉(zhuǎn)座

18、子調(diào)控中的作用機(jī)制，本研究利用深度測(cè)序技術(shù)獲得成年鵪鶉性腺組織small RNAs表達(dá)譜。在睪丸組織中，small RNAs主要集中在24～27nt之間，主要定位于基因組中重復(fù)序列區(qū)域，其次是編碼基因序列，與果蠅中piRNAs的分子遺傳特征相類(lèi)似，推測(cè)禽類(lèi)piRNAs與果蠅piRNAs一樣，在生殖系中參與維持異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，抑制重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座。免疫沉淀的結(jié)果表明，與禽類(lèi)PIWIL1蛋白相結(jié)合的主要是24～25nt之間的piRNA