豬干擾素誘導(dǎo)蛋白BST-2克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性檢測(cè).pdf

1、病毒感染宿主后，依賴于宿主細(xì)胞蛋白的輔助因子，才能完成其感染和復(fù)制周期；同時(shí)宿主細(xì)胞迫于病毒感染的壓力，必須進(jìn)化出各種抵御病毒的方式，病毒和宿主這種相互作用關(guān)系，使雙方在選擇壓力下都得到進(jìn)化。宿主細(xì)胞限制因子是先天免疫系統(tǒng)中的組分，具有抗多種病毒的活性，這些限制因子包括干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白，如TRIM-5a、APOBEC3G、APOBEC3F和BST-2(也稱為Tetherin或CD317)等。
　　 干擾素(Interfer

2、on，IFN)是1957年，英國(guó)病毒生物學(xué)家AlickIsaacs和瑞士研究人員JeanLindenmann在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)的。被病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生一種能作用于其他細(xì)胞并干擾病毒復(fù)制的因子，故將其命名為干擾素。干擾素是一組能誘導(dǎo)人及動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的類激素蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用真核細(xì)胞能夠直接或經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)來(lái)表達(dá)一系列蛋白來(lái)抵抗病毒的感染。BST-

3、2(tetherin，CD317)是一種可以抑制HIV-1從被感染細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，它的抗病毒效能是在對(duì)HIV-1的附屬蛋白Vpu的研究中發(fā)現(xiàn)的，該因子抑制病毒顆粒釋放的作用是通過(guò)蛋白來(lái)介導(dǎo)的，并且在此過(guò)程中，Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的適宜的細(xì)胞環(huán)境也是至關(guān)重要的。
　　 為了研究BST-2的生物學(xué)活性，根據(jù)已發(fā)表的BST-2(Bonemarrowstromalantigen-2)蛋白的cDNA基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，采用反轉(zhuǎn)

4、錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法從豬瘟弱毒疫苗和聚肌胞(PolyI：C)刺激的豬腎細(xì)胞(PK-15)中擴(kuò)增豬BST-2的完整cDNA，并構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-BST-2，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞表達(dá)BST-2蛋白，間接免疫熒光檢測(cè)重組BST-2蛋白的表達(dá)，純化重組蛋白并經(jīng)Bradford法定量，SDS-PAGE及Westernblot檢測(cè)，以純化的蛋白做免疫原免疫小鼠，制備出

5、抗BST-2蛋白的陽(yáng)性血清。利用BST-2蛋白及抗BST-2重組蛋白陽(yáng)性血清研究BST-2各種生物學(xué)活性。
　　 結(jié)果顯示，雙酶切鑒定和核酸序列測(cè)定證實(shí)pcDNA-BST-2真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，經(jīng)間接免疫熒光能夠檢測(cè)到綠色熒光。生物學(xué)活性測(cè)定重組BST-2蛋白具有一定的抗水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus，VSV)、H9禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，