雞傳染性支氣管炎病毒生產(chǎn)用種毒的分子生物學(xué)鑒定方法的研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(AvianInfectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸傳染性疾病，其臨床特征為病雞咳嗽、噴嚏、氣管啰音；幼雞流鼻液：蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和品質(zhì)下降，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。疫苗免疫是當(dāng)前預(yù)防和控制雞傳染性支氣管炎的主要措施，針對(duì)不同致病型或血清型的病毒，國(guó)內(nèi)外均有多種疫苗毒株和疫苗效力評(píng)

2、價(jià)用強(qiáng)毒株。一些毒株用傳統(tǒng)的種毒鑒定方法很難準(zhǔn)確鑒別，尤其是血清型相同的毒株，因此有必要建立分子生物學(xué)鑒別方法，進(jìn)一步完善IBV特異性檢驗(yàn)方法，從而對(duì)IBV種毒進(jìn)行鑒定，并對(duì)國(guó)內(nèi)外疫苗進(jìn)行純凈性檢測(cè)。
　　 本研究以中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種中心保存的不同年代的32株H120株、H52株和M41株種毒為研究對(duì)象，采用自行設(shè)計(jì)的特異性引物經(jīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到病毒的S1蛋白基因片段。經(jīng)過(guò)序列分析，種毒H52中，1993年3月25日

3、與1993年3月28日凍干的H52種毒的S1基因序列與其他代次不同，但與M41株一致。查閱種毒原始記錄，該批次種毒檢定不合格，安全檢驗(yàn)表明接種該批次H52病毒的雞出現(xiàn)了呼吸噦音、甩頭等癥狀。1983年10月7日和1992年12月凍干的種毒與其他幾株相比，分別存在2個(gè)和9個(gè)核苷酸突變。H120種毒中未發(fā)現(xiàn)明顯堿基變異。M41株可分成兩組：79年、88年、91年、96年、93年4月、01年凍干的種毒序列一致；而76年、93年3月、06年凍干

4、的種毒序列一致，與H120相似。
　　 將從GenBank上下載的H52株、H120株、M41株以及歐洲使用的疫苗4/91株的全基因序列(全長(zhǎng)27.6kb)進(jìn)行比對(duì)分析，從中找出他們之間序列差異較明顯的區(qū)域，使用自行設(shè)計(jì)的四對(duì)引物(引物對(duì)A、引物對(duì)B、引物對(duì)C、引物對(duì)D)對(duì)這四種毒株進(jìn)行擴(kuò)增。用引物對(duì)A時(shí)，能擴(kuò)增出M41株全基因組序列中2900～4690bp處長(zhǎng)度為1791bp的目的片斷，所需的M41株最低病毒滴度為103.5E

5、ID50/mL，而無(wú)法擴(kuò)增出H52株和H120株，因此用該對(duì)特異性引物能夠區(qū)分M41株與H52株、H120株。用引物對(duì)B時(shí)，能夠擴(kuò)增出H52株和H120株全基因組序列中21588bp～23288bp處長(zhǎng)度為1700bp的目的片斷，所需的H120(H52)株最低病毒滴度為103.5EID50/mL，再利用限制性內(nèi)切酶Nae I對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切，H120株能夠被切成1000bp和700bp兩個(gè)片斷，而H52株的擴(kuò)增產(chǎn)物由于不存在該酶

6、切位點(diǎn)，所以無(wú)法切開(kāi)。因此利用特異性引物對(duì)B并結(jié)合酶切的方法可以區(qū)分H52株和H120株。使用引物對(duì)C時(shí)，能夠擴(kuò)增出4/91毒株S1基因序列中長(zhǎng)度為1351bp的目的片斷，所需的4/91株最低病毒滴度為102.5EID50/mL，并結(jié)合使用引物對(duì)D進(jìn)行套式PCR就能擴(kuò)增出4/91株S1基因中1066bp的目的片斷，而無(wú)法擴(kuò)增H52株、H120株和M41株，因此使用引物對(duì)C和引物對(duì)D能夠有效區(qū)分4/91疫苗株和H52株、H120株、M41

7、株，三對(duì)引物A、B、c均具有很好的特異性。
　　 從全國(guó)疫苗企業(yè)中隨機(jī)抽取了19個(gè)疫苗企業(yè)共75批IBV活疫苗、從市場(chǎng)上抽取了11個(gè)企業(yè)的共16批IBV活疫苗、從5個(gè)外國(guó)企業(yè)(中國(guó)代理)中共抽取了15批IBV活疫苗，對(duì)其進(jìn)行S1基因測(cè)序并使用上述建立的分子生物學(xué)鑒別方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：H120株疫苗和H52株疫苗用引物對(duì)B進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果符合率為100％，用引物對(duì)C和引物對(duì)D檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)禽苗企業(yè)的75批疫苗中有6個(gè)企業(yè)9批

8、疫苗、市場(chǎng)上抽取的16批禽疫苗中有1批疫苗出現(xiàn)了4/91株特異性片段，而從外企抽取的活疫苗均未出現(xiàn)4/91株特異性片段。綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種中心保存的IBV種毒株的主要免疫原性基因S1基因進(jìn)行測(cè)序分析，并對(duì)IBV的H52株、H120株、M41株及國(guó)外流行疫苗毒株4/91株的全基因組進(jìn)行分析，建立的雞傳染性支氣管炎病毒種毒的分子生物學(xué)鑒別方法，進(jìn)一步完善了種毒特異性檢驗(yàn)方法。并將該方法應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中的雞傳染性支