牙鲆微衛(wèi)星標記的篩選和美洲牡蠣抗病相關基因SNP的初步分析.pdf

1、1.牙鲆微衛(wèi)星分子標記的篩選和鑒定
　　 本研究利用基因組文庫-菌落原位雜交法、構建微衛(wèi)星富集文庫法和利用公共數據庫EST序列分析法篩選牙鲆微衛(wèi)星標記。
　　 1.文庫構建法篩選微衛(wèi)星
　　 構建了牙鲆基因組文庫,通過菌落原位雜交和測序獲得牙鲆微衛(wèi)星序列20個,篩選出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標記8個。通過構建微衛(wèi)星富集文庫和菌落原位雜交法獲得陽性克隆350個,測序結果顯示其中253個克隆含299個微衛(wèi)星序列,其中設計了

2、173對引物,有131對引物能擴增出預期產物,有60對引物的擴增產物呈現多態(tài)性。選取從基因組文庫中獲得的8個多態(tài)性微衛(wèi)星標記和從富集文庫獲得的38個多態(tài)性微衛(wèi)星標記,利用30個野生牙鲆個體對其進行多態(tài)性評價,結果顯示,46個微衛(wèi)星的擴增等位基因數目從4到22個不等,平均等位基因數目為14.3,觀測雜合度和期望雜合度的范圍分別為0.3285～0.9655和0.3854～0.9732,多態(tài)信息含量PIC平均值為0.79。
　　 2.

3、數據庫分析法篩選微衛(wèi)星
　　 利用公共數據庫分析從牙鲆EST庫篩查含有微衛(wèi)星的序列,分析了GenBank數據庫中包含的牙鲆EST序列(截止2010年2月達11111個),其中751EST序列含有微衛(wèi)星序列882個,占分析EST總數的6.76％,其中,二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、和六堿基重復序列分別為444條、254條、53條、95條和40條。選擇了10條含有二堿基重復且側翼序列合適的微衛(wèi)星序列設計引物,并進行引物的優(yōu)化和多態(tài)

4、性的檢測,有8個位點具有多態(tài)性,其等位基因數目為6-12,平均為8.88,觀測和期望雜合度分別為0.3103-0.8346和0.7272-0.8736,多態(tài)信息含量PIC平均值為0.8。在這微衛(wèi)星篩選方法中,EST庫篩查法是最簡便,而且最省人力物力的,另外,構建微衛(wèi)星富集文庫法由于其富集率較高達到80％,相比較基因組文庫法其效率有很大的提高,是大量標記中實現高效低耗的較好選擇。
　　 Ⅱ.美洲牡蠣抗病相關候選基因的單核苷酸多態(tài)性

5、分析
　　 選用美洲牡蠣免疫相關的大防御素基因(CvBD)和絲氨酸蛋白酶抑制因子 1(CvSerpinl),通過重測序的方法,在兩個基因中探尋單核苷酸多態(tài)(SNP)位點,同時選取部分SNP位點,利用高分辨率溶解曲線技術在美洲牡蠣不同地理群體和感染疾病死亡前后選育家系中進行檢測,分析CvBD,CvSerpinl基因的SNP位點與美洲牡蠣感染帕金蟲和尼氏單孢子蟲的死亡相關性。
　　 1.CvSerpSnl基因的單核苷酸多態(tài)性

6、分析
　　 為鑒定牡蠣CvSerpinl基因(絲氨酸蛋白酶抑制因子1基因)與美洲牡蠣感染疾病死亡相關的SNP標記,我們使用來自不同地理群體的30個牡蠣樣本,PCR擴增基因全長并重測序其cDNA外顯子,利用軟件對其序列進行分析,獲得了14個SNP位點,均位于編碼區(qū),其中同義突變5個,非同義突變9個。同時利用不同地理群體和死亡前后選育家系樣本,選擇3個SNP位點,使用高分辨率溶解曲線技術進行SNP檢測和分型,結果顯示只有一個SNP位

7、點CvSPI224(A-C)在群體和家系內均具多態(tài)性,且符合哈迪溫伯格平衡。檢測結果在美國北方(馬塞諸塞州、新澤西州)和南方群體(佛羅里達州、德克薩斯州)之間具有顯著差異,推測差異來源于地理隔離。同時在德克薩斯州和佛羅里達州群體之間檢測結果也存在明顯差異,推測存在差異的原因可能與兩地疾病嚴重程度不同有關。家系間的分析結果表明此位點在死亡前后家系間存在顯著差異,這意味著CvSPI224位點多態(tài)性可能同美洲牡蠣抵抗夏季MSX、Dermo病原

8、感染有著一定的相關性。此結果同LaPeyre等人利用CvSerpinl基因進行的基因表達和感染實驗相一致。
　　 2.CvBD基因的單核苷酸多態(tài)性分析
　　 為鑒定牡蠣CvBD基因(大防御素基因)與美洲牡蠣感染疾病死亡有關的SNP標記,本實驗使用來自不同地理群體的25個牡蠣樣本,PCR擴增基因全長并重測序其CDNA外顯子,對其序列進行分析,獲得了25個SNP位點,除一個一個位于5'非翻譯區(qū)外,其余均均位于編碼區(qū)。在所有S

9、NP位點中,同義突變只有2個,非同義突變達到了23個。SNP位點中極高的NS/S比率揭示此基因可能在進化中受到了強烈的陽性選擇。利用與前文一致的樣本,同樣使用高分辨率溶解曲線技術對其中的3個非同義突變的SNP位點進行SNP檢測和分型,其中2個位點結果在群體和家系內均具有多態(tài)性,并有一定的差異。不同地理群體結果中SNP CvBD378(T-G)僅在南方與北方群體中顯示出顯著的差異,而SNP CvBD90(T-G)位點顯示佛羅里達群體與其他

10、群體存在明顯差異,同時兩位點在群體中對于哈迪溫伯格平衡存在一定的偏離(P＜0.05)。在感染前后家系分析中沒有觀察到明顯的差異,但在XG3家系中兩位點均發(fā)生了偏離孟德爾遺傳比的情況。推測原因可能與該基因中存在拷貝數變異(Copy Numbers Variant,CNV)有關,該變異可能影響鄰近的SNP檢測結果,并使出現連鎖不平衡現象。對于該現象的驗證,需要通過測序和更多的SNP分析來進行。
　　 本論文對于海洋生物的分子標記篩選

11、以及其在抗病育種中的作用進行了初步研究,在牙鲆中利用不同方法獲得了較多的分子標記,并對其多態(tài)性進行了檢測,為下一步構建連鎖圖譜奠定了基礎。對美洲牡蠣疾病候選基因SNP分子標記的研究表明,美洲牡蠣絲氨酸蛋白酶抑制因子1基因中的SNP位點CvSPI224 C基因型與美洲牡蠣對夏季大規(guī)模死亡相關疾病的抗性具有相關性,提示其可作為與美洲牡蠣抗病相關的候選分子標記應用于其抗病育種中,同時為貝類的標記輔助育種提供參考。而大防御素基因的抗病相關分子標