泰樂菌素、恩諾沙星、氟苯尼考對豬肝細胞色素P450、1A2、2E1和3A的影響及其作用機制研究.pdf

1、本研究檢測了泰樂菌素、恩諾沙星與氟苯尼考對豬肝CYP1A2、2E1和3A活性與表達的影響及作用機制，經(jīng)典抑制劑對豬CYP1A和3A亞型的抑制作用，旨在探討藥物對豬CYP1A和3A的影響及影響機制，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容分為以下四個部分:
　　 1.泰樂菌素、恩諾沙星和氟苯尼考對豬肝CYP1A2、2E1與3A活性的影響。以咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗為探針建立了用高效液相色譜法檢查豬肝CYP1A2、CYP3A與CYP

2、2E1活性的Cocktail法，體內(nèi)探針試驗檢測泰樂菌素、恩諾沙星和氟苯尼考對豬肝CYP1A2、CYP2E1與CYP3A活性的影響。選取12頭健康的三元豬，隨機分為四組，分別按10，5，20 mg/kg肌肉注射泰樂菌素、恩諾沙星和氟苯尼考，每天一次，對照組給予等量的生理鹽水，在第11天分別按照10 mg/kg，10 mg/kg，20mg/kg BW的劑量耳緣靜脈給予探針藥物咖啡因、氨苯砜與氯唑沙宗后采血，按所建立的Cocktail法分析

3、三個探針藥物的藥動學參數(shù)的變化。試驗結(jié)果表明連續(xù)10天分別肌注10mg/kg泰樂菌素、5mg/kg恩諾沙星和20 mg/kg氟苯尼考，泰樂菌素組咖啡因的Cl、Vss顯著下降(P＜0.05），AUC、t1/2升高，氯唑沙宗的消除半衰期t1/2顯著減少(P＜0.05），其藥時曲線下面積AUC、穩(wěn)態(tài)表觀分布容積Vss分別只有對照組的65％與88％，清除率則是對照組的1.61倍，說明泰樂菌素可以抑制CYP1A2的活性，誘導CYP2E1的活性;恩

4、諾沙星組的咖啡因代謝的Cl顯著下降(P＜0.05)，Vss、AUC、t1/2分別是對照組的80％、183％與149％，說明恩諾沙星可以抑制CYP1A2的活性;氟苯尼考組的氨苯砜藥時曲線下面積AUC、消除半衰期t1/2與對照組相比，分別只有后者的75％和67％，而清除率則是對照組的1.33倍，提示氟苯尼考對代謝氨苯砜的3A有一定的誘導作用。
　　 2.泰樂菌素、恩諾沙星和氟苯尼考對豬肝CYP1 A2、CYP2E1、CYP3A29、

5、PXR與AhR mRNA表達的影響。為了解這三種常用抗菌藥對CYP450活性誘導的機制，泰樂菌素、恩諾沙星和氟苯尼考按推薦劑量，連續(xù)10天肌肉注射給藥后，采用分光光度計測定對豬肝CYP450含量的影響，普通RT-PCR和熒光定量PCR檢測對豬肝CYP1A2、CYP2E1、CYP3A29、PXR與AhR mRNA表達的影響。結(jié)果表明:各組間細胞色素P450的含量沒有顯著差異(P＞0.05)，熒光定量PCR檢測顯示CYP1A2、CYP2E1

6、、CYP3A29、PXR與AhR基因表達沒有顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果提示泰樂菌素、恩諾沙星和氟苯尼考對豬肝細胞色素P450的CYP450含量、CYP1A2、CYP2E1、CYP3A29、PXR與AhR mRNA表達無顯著影響。
　　 3.泰樂菌素、恩諾沙星、氟苯尼考對豬肝CYP1A2、CYP2E1與3A蛋白表達的影響。泰樂菌素、恩諾沙星與氟苯尼考分別按10、5、20mg/kg肌肉注射給藥，連續(xù)10天，免疫印跡測定對CYP1

7、A2蛋白、2E1蛋白與3A蛋白表達的影響。結(jié)果顯示泰樂菌素使豬肝CYP1A2和3A蛋白表達減少，差異極顯著(P＜0.01);而恩諾沙星對CYP1A2蛋白表達呈現(xiàn)抑制的作用，差異極顯著(P＜0.05);氟苯尼考抑制CYP3A蛋白的表達，差異極顯著(P＜0.05）。沒有觀察到這三個藥物對CYP2E1蛋白表達有影響(P＞0.05)。
　　 4.α萘黃酮和酮康唑及泰樂菌素、恩諾沙星、氟苯尼考對豬CYP1A和CYP3A活性的抑制程度及抑制

8、機制。建立反相高效液相色譜法測定豬肝微粒體中非那西丁、咪達唑侖及其代謝物的方法，測得豬肝微粒體代謝非那西丁和咪達唑侖的動力學特征，研究人CYP1A與CYP3A的經(jīng)典抑制劑α萘黃酮和酮康唑及泰樂菌素、恩諾沙星、氟苯尼考對豬非那西丁0-脫乙基化活性和咪達唑侖1-羥基化活性的抑制程度及抑制機制。取豬肝微粒體混合樣，建立體外孵育體系，以對乙酰氨基酚和1-羥基咪達唑侖的生成速率分別反映CYP1A與CYP3A的活性。豬肝微粒體代謝非那西丁的Vmax

9、為0.3496 nmol/mg/min，Km為12.63μM;代謝咪達唑侖的Vmax為0.4406 nmol/mg/min，Km為7.175μM;α-萘黃酮、恩諾沙星對豬非那西丁的代謝表現(xiàn)為競爭性-非競爭性抑制，IC50分別為8.442μM與141.40μM，Ki分別為8.522μM與193.28μM;泰樂菌素對非那西丁的代謝表現(xiàn)為非競爭性抑制，IC50為53.40μM，Ki為196.15μM，未檢測到氟苯尼考對非那西丁的可逆性抑制作用

10、。酮康唑?qū)ωi咪達唑侖的代謝為非競爭性抑制，IC50為0.03515μM，Ki為0.0362μM;泰樂菌素對豬咪達唑侖的代謝為競爭-非競爭性抑制，IC50為11.13μM，Ki為15.498μM;氟苯尼考對豬咪達唑侖的代謝為為競爭性抑制，IC50為22.40μM，Ki為26.58μM，沒有檢測到恩諾沙星對咪達唑侖的可逆性抑制作用。體外檢測到泰樂菌素、恩諾沙星、氟苯尼考均對非那西丁代謝呈現(xiàn)時間依賴性的不可逆抑制作用，恩諾沙星對咪達唑侖代謝也

11、呈現(xiàn)時間依賴性的不可逆抑制作用。結(jié)果表明，與人相比，豬的CYP1A和3A活性均相近，α-萘黃酮對豬CYP1A的抑制作用不如人強，而人CYP3A的經(jīng)典抑制劑酮康唑?qū)ωi咪達唑侖1-羥基化活性的抑制作用同樣很強，泰樂菌素和恩諾沙星對豬肝微粒體CYP1A的非那西丁代謝有較弱的抑制作用，泰樂菌素和氟苯尼考對豬肝微粒體CYP3A的咪達唑侖代謝則有較強的抑制作用;時間依賴性的不可逆抑制作用可能是導致CYP活性降低的另一個重要原因，最終可能會導致體內(nèi)藥