LP4-2A融合基因在玉米中的亞細胞定位分析.pdf

1、多基因轉化是植物基因工程的研究熱點,連接多肽的使用在一定程度上解決了傳統多基因轉化的不足,為構建多基因載體提供了新的思路,而在轉基因植物中,很多基因產物的作用位點是細胞器,因此其亞細胞定位對活性的發(fā)揮極為關鍵。
　　 本研究利用人工融合的連接肽LP4／2A連接報告基因綠色熒光蛋白EGFP和紅色熒光蛋白DsRed2,在連接肽上游蛋白或下游蛋白分別或同時添加葉綠體信號肽或內質網信號肽,構建不同形式的載體,通過PEG轉化法在玉米原生質

2、體系統中瞬時表達,經細胞水平和分子水平檢測由LA介導的融合基因體系的亞細胞定位情況。
　　 首先構建了利用LA連接的融合基因載體pUgLr、pUCgLr、pUrLCg、pUEgLr、pUgLEr、pUCgLEr和pUErLCg,以及對照載體pUg、pUr、pUEg和pSEb,共十一個載體(U表示Ubi啟動子,g表示gfp,r表示rfp,L表示LP4／2A,C表示葉綠體信號肽Ch1,E表示內質網信號肽Er)。
　　 根據J

3、en Sheen實驗室的實驗指南為藍本進行操作,通過調整各個影響因素,優(yōu)化玉米原生質體PEG瞬時轉化體系:玉米原生質體酶解時間為7～8h,PEG濃度為30％,轉化時間為20min,原生質體量／質粒量為105／10μg,平均1g葉片能獲得約107個原生質體,轉化率為30～50％。
　　 把上述構建的載體通過PEG方法轉化到玉米原生質體中,通過激光共聚焦顯微鏡和western blot檢測分析LP4／2A融合基因體系的亞細胞定位情況

4、,結果表明當體系中只存在一種信號肽時,無論是葉綠體信號肽或內質網信號肽,無論它們是在上游蛋白還是下游蛋白處,都能夠正確引導蛋白的定位,類似的當體系中同時存在葉綠體信號肽和內質網信號肽且無論它們所處的位置,它們都能使連接的蛋白正確定位,由于蛋白的未完全剪切作用,少量的融合蛋白會定位在非預期的亞細胞結構中,同時報告基因的位置并不會影響定位。
　　 根據實驗結果可得出結論:利用LP4／2A介導的融合基因體系能夠在玉米瞬時表達系統中翦切