靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因在蟲(chóng)草真菌中的表達(dá)與特性分析.pdf

1、冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps.）在分類(lèi)上屬于子囊菌綱肉座菌目麥角菌科蟲(chóng)草屬真菌，是我國(guó)古已有之的藥用真菌。蟲(chóng)草生長(zhǎng)于高山雪原，冬天為蟲(chóng)夏天為草，數(shù)量稀少且難于采摘，歷來(lái)在我國(guó)與人參、鹿茸并稱(chēng)為三大補(bǔ)品，其藥用價(jià)值非常廣泛，在保肺益腎、抗癌方面尤為突出。近年來(lái)，隨著蟲(chóng)草各方面藥效的不斷開(kāi)發(fā)和利用，蟲(chóng)草的研究也備受人們的關(guān)注，但對(duì)于其實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)以及在分子生物學(xué)方面的研究卻相當(dāng)鮮見(jiàn)。所以對(duì)蟲(chóng)草進(jìn)行分離鑒定、純化培養(yǎng)、分子學(xué)修飾，研究并提高其免

2、疫調(diào)節(jié)功能的藥用價(jià)值有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　 真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fungal immunomodulatory protein,Fip）是近幾年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白質(zhì)家族，其結(jié)構(gòu)和功能與免疫球蛋白及植物凝集素相似。1989年，Kino等從靈芝（Ganoderma lucidum）中分離純化到第一種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8。隨后，其他免疫調(diào)節(jié)蛋白也被分離得到。該類(lèi)蛋白可以促進(jìn)人類(lèi)末梢淋巴球（human peripher

3、al lymphocytes）細(xì)胞以及白鼠脾淋巴細(xì)胞的增生等，增強(qiáng)人體免疫機(jī)能。將靈芝真菌的免疫調(diào)節(jié)蛋白基因轉(zhuǎn)入冬蟲(chóng)夏草菌中發(fā)揮其強(qiáng)大的醫(yī)療保健效果，不僅為蟲(chóng)草的分子生物學(xué)研究開(kāi)辟了道路，而且可以帶來(lái)非常可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
　　 本研究從采自新疆的冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)體中分離得到冬蟲(chóng)夏草菌絲，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)等多方面研究，鑒定其品種并確定純化到的菌絲為冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps scarabaeicola）。且進(jìn)一步對(duì)蟲(chóng)草的培養(yǎng)

4、條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得較純的生長(zhǎng)旺盛的菌絲體。
　　 用RT-PCR的方法成功從靈芝（Ganoderma lucidum）菌絲體中擴(kuò)增得到真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fip）基因，對(duì)其進(jìn)行修飾，加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)（ER retention signal）KDEL序列，以提高外源蛋白的表達(dá)量。在實(shí)驗(yàn)室真菌轉(zhuǎn)化相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用克隆自香菇的真菌強(qiáng)啟動(dòng)子GPD（三磷酸甘油醛脫氫酶）驅(qū)動(dòng)免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fip）基因，以具有除草劑（PPT）抗性的bar

5、基因作為篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建真菌表達(dá)載體p3300bfipk。然后通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入至冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps scarabaeicola）基因組中，通過(guò)篩選獲得抗性菌株。對(duì)抗性菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到轉(zhuǎn)基因蟲(chóng)草。挑選生長(zhǎng)情況良好的轉(zhuǎn)基因蟲(chóng)草菌株，提取RNA進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分陽(yáng)性菌株中的目的基因均在轉(zhuǎn)錄水平可以檢測(cè)到。
　　 本研究不僅對(duì)蟲(chóng)草進(jìn)行了分子生物學(xué)方面的研究，且為蟲(chóng)草免疫調(diào)節(jié)方