不結(jié)球白菜冷誘導差異表達基因的篩選及功能分析.pdf

1、隨著全球極端災害性天氣頻發(fā)，冷害成為蔬菜生產(chǎn)上的一個嚴重問題，造成蔬菜品質(zhì)下降以及嚴重減產(chǎn)，直接影響冬、春季蔬菜周年供應。冷害影響植物的生長和發(fā)育，包括:滲透脅迫和次級脅迫如過氧化物脅迫等，常常導致植物細胞骨架結(jié)構(gòu)破壞、膜脂相變、細胞水分虧缺、體內(nèi)酶的活性降低和光合速率下降。但植物對冷害脅迫的響應并非是完全被動的，為了適應抵抗冷害，植物在長期的進化過程中，形成了相應的保護機制。對模式植物擬南芥的研究表明，冷馴化是一個由眾多基因協(xié)同調(diào)控，

2、有著復雜調(diào)控網(wǎng)絡的過程，其中少數(shù)關(guān)鍵性調(diào)控基因控制著大量基因的表達。
　　 不結(jié)球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)經(jīng)過一段零度以上的冷誘導，即冷馴化過程，可以獲得一定的抗寒能力，但對其機理的研究較少。采用cDNA-AFLP技術(shù)，以不結(jié)球白菜抗寒自交系043為材料，從轉(zhuǎn)錄組水平上分離冷誘導差異表達的相關(guān)基因，為探明不結(jié)球白菜冷馴化的分子機理提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:

3、r>　　 1.不結(jié)球白菜冷誘導相關(guān)基因差異表達的cDNA-AFLP分析
　　 采用cDNA-AFLP技術(shù)，對不結(jié)球白菜抗寒自交系043在冷誘導(4℃)下差異表達的基因進行了分析，256對引物組合共篩選了9960個cDNA片段，獲得差異片段77個。其中上調(diào)表達的基因片段為57個，下調(diào)表達的基因片段為20個。對其功能比對發(fā)現(xiàn)，這些TDFs分別參與了基礎(chǔ)代謝、光合作用和能量、轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導、次生代謝、防御響應、轉(zhuǎn)錄、細胞骨架結(jié)構(gòu)，另

4、外還有一些假想和功能未知蛋白。同時選取TDF16#、TDF21#和TDF57#進行實時定量PCR分析，結(jié)果表明這三個TDFs受冷脅迫的誘導表達，在不結(jié)球白菜冷馴化過程中可能具有重要作用。構(gòu)建了不結(jié)球白菜在冷誘導下的基因表達譜，從轉(zhuǎn)錄組水平上鑒定了一批冷誘導相關(guān)基因，這些新基因可用于冷馴化的分子機理研究。
　　 2.不結(jié)球白菜冷誘導相關(guān)基因BcWRKY46的克隆及功能分析
　　 WRKY轉(zhuǎn)錄因子能廣泛地參與植物的生物與非生

5、物脅迫反應。以cDNA-AFLP技術(shù)，從不結(jié)球白菜抗寒自交系043冷誘導(4℃)的葉片中得到的一個差異表達片段TDF21#，進一步利用RACE技術(shù)獲得了該基因cDNA全序列1175 bp，包含有855bp的開放閱讀框，編碼284個氨基酸，命名為BcWRKY46。qRT-PCR結(jié)果表明，該基因表達不僅受冷脅迫誘導，還響應其它脅迫，包括鹽、干旱和ABA。過量表達BcWRKY46的轉(zhuǎn)基因煙草提高了抗寒、鹽、干旱和ABA脅迫的能力。結(jié)果表明，B

6、cwRKY46在提高ABA和非生物脅迫的抗性過程中有著重要的作用。
　　 3.不結(jié)球白菜冷誘導相關(guān)基因BcMCSU的克隆及功能分析
　　 采用cDNA-AFLP技術(shù)，從不結(jié)球白菜抗寒自交系043冷誘導(4℃)的葉片中得到的一個差異表達片段TDF16#，進一步利用RACE技術(shù)獲得了該基因全長序列1194 bp，包含有926 bp的開放閱讀框，編碼307個氨基酸，命名為BcMCSU。其氨基酸序列與擬南芥AtMCSU編碼的氨基

7、酸序列具有較高同源性。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明:所推導的氨基酸序列具有完整的結(jié)構(gòu)，在其N-端和C-端分別含有一個MOSC結(jié)構(gòu)域。采用Gateway技術(shù)構(gòu)建植物過量表達載體，通過農(nóng)桿菌介導的真空滲透法將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，經(jīng)除草劑篩選，獲得了抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥。
　　 4.不結(jié)球白菜冷誘導相關(guān)基因BcVIN3的克隆及功能分析
　　 采用cDNA-AFLP技術(shù)，從不結(jié)球白菜抗寒自交系043冷誘導(4℃)的葉片中得到的一個差異表達片